楊國雷++尹松梅++張復(fù)華+牛國敏++凌奕文

[摘要] 目的 探討GPⅡb/Ⅲa 拮抗劑RGDS和鈣通道拮抗劑Nifedipine對ADP誘導(dǎo)的血小板GPⅡb/Ⅲa活化的影響。方法GP II b/11I a特異性抗體PAC-1標(biāo)記活化GP II b/11I a，流式細(xì)胞儀檢測靜息及 ADP（ 5μmol/L）誘導(dǎo)的血小板PAC-1表達(dá)率。結(jié)果 靜息狀態(tài)下的血小板PAC-1表達(dá)率為（0.80±0.85）%；在ADP（5 μmol/L）激動下，PAC-1表達(dá)率為（77.27±9.47） %；RGDS以濃度依賴性的方式抑制PAC-1 表達(dá)率，IC50值為206 μmol/L；Nifedipine能以濃度依賴性的方式抑制PAC-1 表達(dá)率，IC50 值為178 μmol/L；RGDS聯(lián)合Nifedipine對PAC-1 表達(dá)的聯(lián)合抑制率為（60.15±16.35）%，二者的交互效應(yīng)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論GPIIb/IIIa受體拮抗劑RGDS和Ca2+拮抗劑Nifedipine均抑制ADP誘導(dǎo)的血小板GPIIb/IIIa活化，其抑制作用呈濃度依賴性，隨拮抗劑濃度增加抑制作用增強(qiáng)；兩者對血小板GPIIb/IIIa活化的抑制存在協(xié)同作用。

[關(guān)鍵詞] 血小板活化；GPⅡb/Ⅲa拮抗劑；鈣通道拮抗劑；PAC-1

[中圖分類號] R96 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742（2014）04（a）-0014-02

血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物活化，空間構(gòu)型改變，暴露纖維蛋白結(jié)合位點(diǎn)，是血小板活化的關(guān)鍵。Ca2+是GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物作為一個完整的功能單位存在的必要因素，同時參與GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物構(gòu)型改變及活化[1]。該研究2010年7月—2011年3月期間采用GPⅡb/Ⅲa 拮抗劑RGDS（Arg-Gly-Asp-Ser）和鈣通道拮抗劑Nifedipine兩種藥物，旨在觀察二者對ADP誘導(dǎo)的血小板GPⅡb/Ⅲa活化的影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

于該院體檢中心體檢的健康體檢者24人，20～40歲，平均26歲，性別不限，近1個月無用藥史；排除冠心病、高血壓、糖尿病患者及妊娠女性?？崭?12 h靜脈采血， ACD液（1：9）抗凝。

1.2 主要試劑及材料

RGDS、Nifedipine、ADP（美國 Sigma）；Mouse IgM：FITC、PAC-1 FITC（FITC標(biāo)記活化GP II b/11I a特異性抗體），CD61：PerCP，（美國 BDIS）。FACSort型流式細(xì)胞儀 （B-D 美國）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 血小板膜糖蛋白GPIIb/IIIa測定 ACD液抗凝靜脈血2 mL，分成每份90 μL，加入ADP（5 μmol/L）孵育5min，實(shí)驗(yàn)組加入PAC-1：FITC、CD61：PerCP，對照組分別加入Mouse IgM：FITC、 CD61：PerCP 染色，室溫下作用20 min ，立即加入2～8℃的%甲醛溶液1 mL，置 2～8 ℃冰箱內(nèi)固定30 min，24 h內(nèi)上機(jī)檢測。每次檢測時取5 μL標(biāo)本，以CD61PerCP/SSC雙參數(shù)設(shè)門，檢測PAC-1陽性血小板的百分率[2]。

1.3.2 RGDS、Nifedipine單獨(dú)對血小板PAC-1表達(dá)率的作用 制備處理標(biāo)本同上，靜息組不加ADP直接測定， 對照組加入ADP，藥物組分別加入5種不同濃度的 RGDS（50、100、200、400、800 μmol/L），Nifedipine（10、20、40、80、160 μmol/L）于37 ℃ 孵育10 min后加入ADP；其余各步驟相同。

1.3.3 RGDS聯(lián)合Nifedipine對血小板PAC-1表達(dá)率的聯(lián)合作用 制備處理標(biāo)本同上， 藥物組同時加入RGDS（200 μmol/L）及 Nifedipine（160 μmol/L）于37 ℃孵育10 min后加入ADP；其余各步驟相同前。

1.3.4 Nifedipine（160μmol/L）和RGDS（200 μmol/L）對血小板PAC-1 表達(dá)率的聯(lián)合作用 Nifedipine（160 μmol/L） 對血小板PAC-1抑制率為（44.35±22.81）%；RGDS（200 μmol/L） 對血小板PAC-1 的抑制率為（51.64±17.14）%；二者對血小板PAC-1的聯(lián)合抑制率為（60.15±16.35）%，經(jīng)析因設(shè)計的方差分析，二者的主效應(yīng)與交互效應(yīng)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。即二者對PAC-1 表達(dá)率的抑制存在協(xié)同作用。

1.4 統(tǒng)計方法

計量資料的描述用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示；PAC-1表達(dá)抑制率=[（對照組PAC-1表達(dá)率一用藥后PAC-1表達(dá)率）/對照組PAC-1 表達(dá)率]x100%。不同濃度藥物的單獨(dú)效應(yīng)用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計的方差分析；聯(lián)合效應(yīng)用析因設(shè)計的方差分析；所有數(shù)據(jù)均用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理。

2 結(jié)果

2.1 ADP誘導(dǎo)的血小板GPIIb/IIIa活化

正常人，靜息狀態(tài)下的血小板PAC-1表達(dá)率為（0.80±0.85）%；在ADP（5 μmol/L）激動下，PAC-1表達(dá)率增高，為（77.27±9.47） %。

2.2 RGDS對血小板PAC-1 表達(dá)率的作用

5種不同濃度的 RGDS對PAC-1 表達(dá)率均有抑制作用，IC50值為206 μmol/L。隨著RGDS濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)，經(jīng)隨機(jī)區(qū)組設(shè)計的方差分析及SNK法多重對比，各濃度的效應(yīng)有統(tǒng)計學(xué)意義，即RGDS能以濃度依賴性的方式抑制PAC-1 表達(dá)率。

2.3 Nifedipine對血小板PAC-1表達(dá)率的作用endprint

5種不同濃度的Nifedipine對PAC-1表達(dá)率均有抑制作用，IC50 值為178 μmol/L。隨著Nifedipine濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)，經(jīng)隨機(jī)區(qū)組設(shè)計的方差分析及SNK法多重對比，各濃度的效應(yīng)有統(tǒng)計學(xué)意義，即Nifedipine能以濃度依賴性的方式抑制PAC-1 表達(dá)率。

3 討論

血小板活化的早期標(biāo)志是血小板膜糖蛋白GPⅡb/11a復(fù)合物構(gòu)型從靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)。本實(shí)驗(yàn)所采用GPIIb/IIIa受體單克隆抗體PAC-1，僅與活化GPIIb/IIIa結(jié)合，故其表達(dá)率反映GPIIb/IIIa的活化。該研究我們采用以上5個不同濃度的RGDS，發(fā)現(xiàn)RGDS能以濃度依賴性地方式抑制PAC-1表達(dá)率，隨著濃度的增加，抑制率上升。RGDS能夠產(chǎn)生上述效應(yīng)，目前認(rèn)為與以下方面有關(guān)：①GPIIb/IIIa活化的主要途徑是依賴蛋白激酶C（PKC）對GPIIIa胞內(nèi)區(qū)Ser/Thr殘基磷酸化，產(chǎn)生“內(nèi)向外”的活化信號實(shí)現(xiàn)[3]；RGDS能抑制血小板GPIIb/IIIa受體磷酸化。②GPIIb/IIIa受體拮抗劑能夠阻斷纖維蛋白原與GPIIb/IIIa結(jié)合，能抑制GPIIb/IIIa 活化的“外向內(nèi)”信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[4]。Ca2+激活PKC， PKC磷酸化GPIIb/IIIa胞內(nèi)段及肌球蛋白輕鏈（MLC），使GPIIb/IIIa活化[5]。此外，Ca2+與鈣調(diào)蛋白（CaM），組成Ca2+-CaM復(fù)合物，能激活肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK），MLCK磷酸化MLC，骨架蛋白重組，收縮，使GPIIb/IIIa活化[6]。該研究采用以上5個不同濃度的Nifedipine，發(fā)現(xiàn)Nifedipine能濃度依賴性地抑制 PAC-1表達(dá)率，隨著濃度的增加抑制率增強(qiáng)。

多年來，研究者一直探索血小板GPIIb/IIIa復(fù)合物與鈣通道的關(guān)系。Tetsuro等采用電生理技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)纖維蛋白原與GPIIb/IIIa后，鈣內(nèi)流增加；GPIIb/IIIa復(fù)合物解離或GPIIb/IIIa拮抗劑抑制鈣內(nèi)流。血小板膜糖蛋白GP II b/IIIa復(fù)合物膜胞內(nèi)端除可與細(xì)胞骨架等結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)合外，還可與多種信號蛋白如整合素連接激酶（ILK）、蛋白激酶C（PKC） 等結(jié)合，對細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響，除可通過對細(xì)胞膜上鈣通道的作用外，也可影響細(xì)胞內(nèi)鈣庫（如線粒體、 內(nèi)織網(wǎng)等含鈣高的細(xì)胞器）的釋放[7]。研究發(fā)現(xiàn)在GPIIb/IIIa受體拮抗劑RGDS存在的情況下，血小板經(jīng)凝血酶激活劑作用后的[Ca ]i 升高受到抑制[8]。以上可以看出，GPIIb/IIIa復(fù)合物參與調(diào)節(jié)鈣通道活性，但二者具體的關(guān)系尚需進(jìn)一步探討。該實(shí)驗(yàn)觀察了200 μmol/L的RGDS與160 μmol/L的Nifedipine對ADP （5 μmol/L）誘導(dǎo)的血小板AC-1表達(dá)率的聯(lián)合效應(yīng)。發(fā)現(xiàn)RGDS與Nifedipine對PAC-1表達(dá)率的主效應(yīng)及交互效應(yīng)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），說明RGDS聯(lián)合Nifedipine對GPIIb/IIIa活化的抑制存在協(xié)同作用。

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（收稿日期：2013-12-24）endprint