周璐麗 王定發(fā) 周漢林 侯冠彧 李韋

摘 要 采用倍比稀釋法，評(píng)價(jià)了檳榔青果的乙醇提取物對(duì)豬雞養(yǎng)殖中常見致病菌的抗菌作用。結(jié)果表明：提取物對(duì)雞大腸桿菌、雞沙門氏菌、雞金黃色葡萄球菌、豬大腸埃希菌、豬金黃色葡萄球菌等5種致病菌有一定的抑菌作用，最低抑菌濃度（MIC）分別為62.5、31.25、31.25、62.5、62.5 g/L，而最低殺菌濃度（MBC）分別為125、62.5、62.5、125、125 g/L。

關(guān)鍵詞 檳榔提取物 ；大腸桿菌 ；沙門氏菌 ；金黃色葡萄球菌 ；最低抑菌濃度 ；最低殺菌濃度

分類號(hào) S852.61 ；R285.5

檳榔屬于棕櫚科植物，為中國(guó)五大南藥之首，主要產(chǎn)于我國(guó)海南、廣東、廣西、云南、福建和臺(tái)灣等地。檳榔主要含有生物堿、鞣質(zhì)、油脂等化學(xué)成分[1]，具有殺蟲消積、降氣等功效，是常用的驅(qū)蟲、消積藥物，對(duì)于腸道寄生蟲、痢疾腹瀉、腳氣腫脹等具有較好的療效[2]。目前相關(guān)研究大多集中于檳榔提取物的驅(qū)蟲作用[3-5]、抗氧化[6-8]、促進(jìn)胃腸道蠕動(dòng)[9]等方面。

腸毒性大腸桿菌、沙門氏菌以及金黃色葡萄球菌是較常見的引起人類和畜禽細(xì)菌性腸道疾病的致病菌，嚴(yán)重危害人類和動(dòng)物的安全。隨著我國(guó)畜禽養(yǎng)殖的發(fā)展，畜禽腸道致病菌多重感染、抗生素長(zhǎng)期大量使用帶來的畜產(chǎn)品安全問題日益突出，因此急需開發(fā)抗菌活性高、低毒性、低殘留、廣譜的飼料添加劑以提高畜禽腸道細(xì)菌多重感染性疾病的控制水平。目前對(duì)檳榔抗細(xì)菌，特別是常見的腸道致病菌方面研究較少。本研究針對(duì)豬雞生產(chǎn)中常見的幾種致病菌（豬、雞大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、雞沙門氏菌），探討檳榔乙醇提取物的體外抑菌效果，為開發(fā)以檳榔提取物為主的飼料添加劑應(yīng)用于豬雞養(yǎng)殖提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

檳榔（Areca catechu）青果采自儋州市中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶植物園。氫溴酸檳榔堿標(biāo)準(zhǔn)品購自中國(guó)食品藥品檢定研究院。雞大腸桿菌（CVCC249）、雞沙門氏菌（CVCC533）、雞金黃色葡萄球菌（CVCC1885）、豬大腸埃希菌（CVCC224）、豬金黃色葡萄球菌（CVCC546）標(biāo)準(zhǔn)菌株，均購自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、Baird-Parker瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 檳榔提取物制備

將檳榔青果切開，65℃烘干，粉碎。稱取50 g烘干粉碎樣，加入700 mL 85%乙醇，85℃，熱回流提取2 h，減壓抽濾，得濾液后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得浸膏，用丙酮定容至50 mL，即得1000 g/L溶液（按原料算），用一次性濾菌器過濾除菌。

1.2.2 菌懸液制備

將5種菌株分別接種到2 mL滅菌營(yíng)養(yǎng)肉湯試管中進(jìn)行純培養(yǎng)。取0.5 mL純培養(yǎng)后菌懸液，加入到4.5 mL的滅菌營(yíng)養(yǎng)肉湯中，依次進(jìn)行10倍倍比稀釋，采用10-5、10-6、10-7和10-8濃度涂板，每個(gè)濃度3個(gè)平行，選取菌落數(shù)在30～300之間進(jìn)行計(jì)數(shù)。算得菌懸液濃度后，將其配制成10×105 CFU/mL試驗(yàn)菌液。

1.2.3 檳榔提取物中檳榔堿含量測(cè)定

參照劉文杰（2012）[10]方法，采用比色法測(cè)定檳榔提取物中檳榔堿的含量。

1.2.4 最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）測(cè)定

采用試管倍比稀釋法，取24支試管，分為3組，每組8支。用移液槍吸取1 mL滅菌營(yíng)養(yǎng)肉湯于每支試管，再于每組第1支試管加入1 mL檳榔提取物溶液（1000 g/L），搖勻，然后再從每組第1管吸取1 mL混合溶液加入第2支試管，混勻后，再從第2支試管吸取1 mL混合溶液加入第3支試管，依次類推一直到第6管，再從第6管吸取1 mL混勻液去掉。第7管為陽性對(duì)照，第8管為陰性對(duì)照。將1 mL 10×105 CFU/mL試驗(yàn)菌液分別加入到上述各管中，陰性對(duì)照加入1 mL滅菌營(yíng)養(yǎng)肉湯。混勻后，將上述試管放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

按照文獻(xiàn)[11]判定最低抑菌濃度（MIC）：首先觀察細(xì)菌陽性對(duì)照組長(zhǎng)菌呈渾濁狀態(tài)，而陰性對(duì)照組不長(zhǎng)菌呈透明清亮狀的前提下，觀察各濃度組的渾濁情況，以判斷不同濃度檳榔提取物的抑菌作用。如試管內(nèi)呈嚴(yán)重渾濁，表明有細(xì)菌生長(zhǎng)，用“++”表示；如輕微渾濁，用“+”表示；如試管內(nèi)透明清亮，表明無細(xì)菌生長(zhǎng)，用“-”表示。

1.2.5 最低殺菌濃度（minimal bacteriocidal concentration，MBC）測(cè)定

吸取上述澄清透明的的各試管培養(yǎng)物0.2 mL，將含有雞和豬大腸桿菌的培養(yǎng)物接種到麥康凱培養(yǎng)基培養(yǎng)板上；含有雞沙門氏菌的試管培養(yǎng)物接種到SS瓊脂培養(yǎng)基上，含有金黃色葡萄球菌試管培養(yǎng)物接種到Baird-Parker瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，每個(gè)試管接種到3個(gè)培養(yǎng)基作為重復(fù)，編號(hào)，37℃培養(yǎng)24 h，觀察有無細(xì)菌生長(zhǎng)，以培養(yǎng)板上計(jì)數(shù)少于5個(gè)菌落作為對(duì)應(yīng)的試管內(nèi)藥物濃度為該菌株的最低殺菌濃度（MBC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 檳榔提取物中檳榔堿含量

測(cè)得檳榔干粉中檳榔堿含量為0.37%，提取物溶液1000 g/L溶液（按原料算）中檳榔堿濃度為3.7 g/L。

2.2 檳榔提取物對(duì)幾種致病菌的抑菌效果

不同濃度檳榔提取物對(duì)幾種畜禽致病菌株的抑菌效果見表1。結(jié)果表明，檳榔提取物對(duì)雞沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的MIC 為31.25 g/L，對(duì)雞大腸桿菌、豬大腸埃希菌、豬金黃色葡萄球菌的MIC為62.5 g/L。

檳榔提取物對(duì)幾種畜禽致病菌株的最低殺菌濃度見表2。結(jié)果表明，檳榔提取物雞沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的MBC 62.5 g/L，對(duì)雞大腸桿菌、豬大腸埃希菌、豬金黃色葡萄球菌的MBC 125 g/L。

3 討論與結(jié)論

由于產(chǎn)地和品種的不同，檳榔中檳榔堿含量略有差異，一般檳榔中檳榔堿含量為0.3%～0.6%[12]，在本次試驗(yàn)中通過分光光度法測(cè)得檳榔中檳榔堿含量為0.37%。

黃玉林等研究了采用索式提取法提取的檳榔提取物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、米曲霉、黃曲霉6種菌的體外抗菌作用。結(jié)果表明，檳榔提取物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有較好的抗菌作用，對(duì)釀酒酵母、米曲霉、黃曲霉沒有抗菌作用[13]。劉文杰等采用雙層平板打孔法研究了檳榔殼乙醇提取物對(duì)食品中幾種常見的的細(xì)菌和真菌的抑制作用。結(jié)果表明，檳榔殼乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、大腸桿菌的MIC分別為8.75、4.375、35和35 g/L，而對(duì)真菌釀酒酵母、黑曲霉、根霉沒有抑制作用[10]，其對(duì)大腸桿菌的MIC與本試驗(yàn)中對(duì)雞大腸桿菌的MIC較為接近。本試驗(yàn)中，檳榔提取物雞沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及豬大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的MIC分別為62.5、31.25、31.25、62.5和62.5 g/L，表明檳榔提取物對(duì)雞大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有較好的抑制作用。對(duì)雞和豬金黃色葡萄球菌的MIC的差異，可能由于金黃色葡萄球菌菌株的宿主不同而導(dǎo)致的耐藥性差異導(dǎo)致。

大腸桿菌、沙門氏菌、大腸埃希菌等致病菌感染動(dòng)物后主要造成消化道疾病，如新生幼畜腹瀉、痢疾等。而致病性金黃色葡萄球菌感染動(dòng)物后會(huì)引起局部化膿感染以及敗血癥等。眾所周知，抗生素添加劑在畜牧業(yè)生產(chǎn)中長(zhǎng)期、大量使用造成藥物殘留，已嚴(yán)重影響到畜產(chǎn)品的質(zhì)量，另外抗生素的濫用導(dǎo)致嚴(yán)重多重耐藥與交叉耐藥。植物提取物本身具有低毒、低殘留、低耐藥性，是抗生素所不具備的。而且植物提取物往往并不僅體現(xiàn)在抑菌方面，更重要的是植物提取物中含有的多種活性成分能夠調(diào)動(dòng)動(dòng)物機(jī)體的免疫力，達(dá)到抵抗病原微生物的目的。因此，開發(fā)植物飼料添加劑具有重要的意義。本次研究表明，檳榔乙醇提取物對(duì)五種豬雞主要致病菌具有一定的抑制作用，且對(duì)雞大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有較好的抑制作用，其MIC為31.25 g/L，但對(duì)一些耐藥菌株及不同提取成分的抑菌機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

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