張慧君 華玉偉 黃天帶 黃華孫

摘 要 以巴西橡膠樹花藥為外植體，研究了巴西橡膠樹花藥體胚發(fā)生過程中抗氧化酶活性和某些生理參數(shù)的變化。結(jié)果表明，橡膠樹花藥體胚發(fā)生過程中，SOD活性變化表現(xiàn)在培養(yǎng)30 d達到最高值，而后下降平緩；丙二醛（MDA）含量在第60天達到最高。生理參數(shù)的變化表現(xiàn)為可溶性蛋白含量0 d含量最高，可溶性糖的含量在50 d達到最高，據(jù)此認為，SOD和MDA對橡膠樹花藥體胚的誘導起主導作用，可溶性蛋白含量與不定芽的發(fā)生密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹 ；體胚發(fā)生 ；抗氧化酶活性 ；可溶性蛋白含量

分類號 S794.1

植物離體培養(yǎng)過程中體細胞胚胎的發(fā)生，是由愈傷組織先形成胚狀體，再由胚狀體發(fā)育成完整植株，其生理生化特征的改變，是植物外植體外部形態(tài)特征的外部反映，這些變化決定著外植體發(fā)育的方向[1]。本研究以巴西橡膠樹花藥為外植體，在適合的培養(yǎng)基中誘導產(chǎn)生體胚，在體胚不同發(fā)育時期測定其生理生化指標，以探索其生理生化特性，對于橡膠樹體細胞胚發(fā)生研究具有重要意義。

SOD是重要的抗氧化酶，其活性的高低能直接反映植物清除活性氧能力的大小[2]。SOD主要清除超氧化物陰離子自由基，POD和CAT主要清除H2O2，三種酶相互作用可以有效清除活性氧，并防止膜脂過氧化。許多學者研究表明，外植體抗氧化酶活性的變化與外植體細胞的分化有直接的關(guān)系[3-6]。細胞膜脂過氧化水平的程度，MDA是重要衡量指標，又是一種能強烈的與細胞內(nèi)各種成分發(fā)生反應(yīng)的主要物質(zhì)，因而引起酶和膜的嚴重損傷，膜電阻及膜的流動性降低，最終導致了膜結(jié)構(gòu)及生理完整性的破壞[7]。當活性氧積累超過抗氧化酶系統(tǒng)的清除能力時，導致活性氧及丙二醛（MDA）積累，導致膜透性增大[8-9]。

本研究以巴西橡膠樹花藥體胚的誘導發(fā)生為基礎(chǔ)進行組織培養(yǎng)，研究了巴西橡膠樹花藥體胚發(fā)生過程中外植體內(nèi)部抗氧化酶活性和MDA含量的變化趨勢，旨在探討橡膠樹體胚發(fā)生的生理生化機理，為巴西橡膠樹花藥再生體系的優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料以巴西橡膠樹優(yōu)良無性系熱研 7-33-97花藥為試材，花藥培養(yǎng)方法參照Hua等[10]的方法。

1.2 方法

1.2.1 生理參數(shù)測定

分別準確稱取花藥愈傷在體胚誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)0、10、20、30、40、50和60 d新鮮外植體材料0.2 g，在4℃預(yù)冷的研缽中，加入5 mL PBS緩沖液（pH7.8）研磨，使最終添加量為5 mL。10 000 r/min離心10 min，取上清液冷藏于冰盒中，用于各項生理指標的測定。重復3次。

采用NBT光化還原法測定SOD活性[11]。以SOD抑制NBT的光化學還原50%時的酶用量為一個酶活性單位。

采用考馬斯亮蘭G-250法測定可溶性蛋白含量，以牛血清白蛋白做標準曲線，計算各樣品的蛋白質(zhì)濃度。采用蒽酮法測定可溶性糖[12]。采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定丙二醛（MDA）含量，參照張志良[13]的方法，計算MDA含量。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2007軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 巴西橡膠樹花藥體胚發(fā)生過程中SOD活性的變化

SOD（超氧化物歧化酶）是需氧生物中普遍存在的一種酶，它能夠防御活性氧或其他過氧化物自由基對細胞膜系統(tǒng)的傷害。從圖1可知，即在培養(yǎng)初期，外植體超氧化物歧化酶（SOD）活性最低，第30天出現(xiàn)最高峰，由于此階段愈傷組織開始形成體胚，體積增大，外植體對營養(yǎng)物質(zhì)的需求逐漸增加而使SOD活性呈上升趨勢[14]。而此時正是心形體胚生長的時期，這說明SOD活性升高對早期子葉胚的發(fā)生有促進作用。在培養(yǎng)的40～60 d，外植體組織處于旺盛的生長階段，SOD活性逐漸下降。

2.2 MDA含量的變化

丙二醛（MDA）含量能反應(yīng)細胞膜脂過氧化作用強弱和質(zhì)膜破壞程度的重要指標之一[15]。在巴西橡膠樹花藥體胚的誘導過程中，MDA含量變化較大（圖2）。在第60天達到最高，這可能也與其再生產(chǎn)生不定芽相關(guān)，但MDA含量20～50 d總體差異不是很大。

2.3 可溶性蛋白含量的變化

隨著愈傷組織的進一步發(fā)育，其可溶性蛋白含量也發(fā)生一定的變化。由圖3可以看出，可溶性蛋白含量最高值出現(xiàn)在0 d，隨后下降。在培養(yǎng)的20、30 d出現(xiàn)小高峰?？扇苄缘鞍缀糠逯档母叩图俺霈F(xiàn)時間的不同，與體胚的生長也有重要關(guān)系，在培養(yǎng)的初期，即愈傷時期，蛋白含量最高，之后隨著愈傷組織的生長而變化。

2.4 可溶性糖含量的變化

測定可溶性糖含量結(jié)果表明，在體胚發(fā)生階段，從0 d開始可溶性糖含量出現(xiàn)上升，但速度緩慢，在第50天達到含量最高，而后下降，而此時正是子葉胚時期。可見，子葉胚形成后，可溶性糖含量明顯下降。

3 討論

巴西橡膠樹花藥體胚的發(fā)生是一個極其復雜的過程，伴隨著一系列的外植體生理生化變化，這些變化在形態(tài)轉(zhuǎn)變之前已經(jīng)發(fā)生。許多研究表明，SOD是植物體內(nèi)氧代謝的關(guān)鍵酶，是細胞的一種保護酶和誘導酶[14]。本試驗研究結(jié)果表明，SOD活性的高峰在愈傷組織培養(yǎng)第30天出現(xiàn)，與關(guān)正君[15]、何夢玲[16]試驗結(jié)果相似。這可能是巴西橡膠樹愈傷組織初始階段形成過程中過多的氧自由基，SOD酶可用于清除這些自由基，致使代謝水平和呼吸作用增強。而后隨著花藥體胚的旺盛生長，多余的超氧自由基被還原為H2O，不斷減少的超氧自由基，使得SOD活性變化較為緩慢，并且呈現(xiàn)出下降趨勢。由于外植體對培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)，所以受到外部環(huán)境條件的影響，SOD酶活性也在發(fā)生變化，這也是在出現(xiàn)了高峰后伴隨酶活性下降的原因。

可溶性蛋白質(zhì)含量的高低可以間接反映出細胞各種代謝活動的強弱，在植物組織培養(yǎng)中中起著重要的作用[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，在花藥外植體培養(yǎng)30 d后，外植體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量呈下降趨勢，并且可溶性蛋白呈現(xiàn)最高值，這可能是由于細胞內(nèi)原有的可溶性蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎麊訒r所需的物質(zhì)，并且新的蛋白質(zhì)還未合成。當細胞開始分裂增殖時，細胞內(nèi)開始合成可溶性蛋白質(zhì)，因此升高，30 d時，隨愈傷組織衰老時又降低。丙二醛（MDA）含量體現(xiàn)在培養(yǎng)60 d時最高，可見與子葉胚形成有關(guān)。

碳水化合物在植物體胚發(fā)生過程中起著重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，可溶性糖含量培養(yǎng)前期含量緩慢上升，而培養(yǎng)50 d后，開始下降。表明可溶性糖含量與子葉胚形成關(guān)系密切。陳陸琴等[17]研究發(fā)現(xiàn)，合歡、金蓮花莖尖從愈傷組織分化出芽，在前12 d的培養(yǎng)中，糖含量呈現(xiàn)迅速增長的趨勢，而后糖含量逐漸下降。這可能是由于可溶性糖作為外植體分化細胞的碳骨架原料，愈傷組織增殖時，需要更高的糖來提供原料供應(yīng)。

參考文獻

[1] 王 熊.激素對植物培養(yǎng)細胞生化的調(diào)節(jié)作用[J]. 細胞生物學，1983，3（5）：40-45.

[2] Fridovich I.The biology of oxygen radical，the supemxide radical is an agent of oxygen toxicity：superoxide dismutase provide an important defence[J]. Science， 1978， 201： 875-880.

[3] 崔凱榮，任紅旭，邢更生，等.枸杞組織培養(yǎng)中抗氧化酶活性與體細胞胚發(fā)生相關(guān)性的研究[J].蘭州大學學報（自然科學版），1998，34（3）：93-99.

[4] 王敬文，蔣 晶. 低溫馴化的黑荊樹懸浮培養(yǎng)細胞中可溶性蛋白含量變化[J]. 林業(yè)科學研究，1993，6（6）：661-665.

[5] 崔凱榮，王曉哲，陳 雄，等. 小麥體細胞胚發(fā)生中DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成動態(tài)[J]. 核農(nóng)學報，1997，11（4）：209-214.

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