閆鑫磊 計(jì)永勝 田秀玲 索靜霞 劉賢勇 索 勛

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京100193)

頂復(fù)門原蟲包括瘧原蟲、弓形蟲、隱孢子蟲、艾美耳球蟲等多種寄生蟲，可感染包括人在內(nèi)的幾乎所有脊椎動(dòng)物，由此引發(fā)的瘧疾、弓形蟲病、隱孢子蟲病及球蟲病給人類社會(huì)造成了巨大的損失 (Sibleyetal., 2011)。作為專性胞內(nèi)寄生病原，頂復(fù)門原蟲在細(xì)胞內(nèi)的繁殖周期均需經(jīng)過入侵、胞內(nèi)增殖及從宿主細(xì)胞中逸出3個(gè)過程，蟲體逸出后可以繼續(xù)入侵周圍細(xì)胞開始下一個(gè)胞內(nèi)周期 (Plattneretal., 2008)。在上述3個(gè)過程中，逸出作為兩次胞內(nèi)周期的連接點(diǎn)對(duì)于頂復(fù)門原蟲的生存和繁殖具有舉足輕重的作用(Roikoetal., 2009)。因此，對(duì)該過程的研究有助于了解這類寄生原蟲的致病機(jī)理，為開發(fā)新型有效的抗寄生蟲藥物提供科學(xué)依據(jù)。

剛地弓形蟲作為頂復(fù)門原蟲的模式生物，有關(guān)其逸出的研究相對(duì)成熟。研究表明，剛地弓形蟲的逸出是一個(gè)主動(dòng)過程，依賴于蟲體或宿主細(xì)胞的離子濃度變化，尤其是與鈣離子濃度密切相關(guān)(Moudyetal., 2001; Arrizabalagaetal., 2004a)。同時(shí)，蟲體自身的蛋白也參與了逸出過程，如微線體(Microneme)蛋白在逸出過程中可大量分泌(Carruthersetal.,1999)，穿孔素樣蛋白(TgPLP)能夠穿透帶蟲空泡膜 (Kafsacketal., 2009)，敲除剛第弓形蟲的鈉氫交換通道蛋白TgNHE1 (Arrizabalagaetal., 2004b) 或鈣依賴性蛋白激酶1TgCDPK1 (Rezzonicoetal., 1995) 可以影響蟲體的運(yùn)動(dòng)能力等。

頂復(fù)門原蟲的另一種重要病原艾美耳球蟲主要寄生于畜禽腸道，其從腸上皮細(xì)胞逸出的過程是誘發(fā)畜禽球蟲病的主要原因之一。然而，有關(guān)艾美耳球蟲逸出的研究較少，更鮮有報(bào)道涉及其分子機(jī)制。本課題組于近期通過體外研究發(fā)現(xiàn)，激活后的淋巴細(xì)胞可在非接觸的情況下誘導(dǎo)柔嫩艾美耳球蟲子孢子從被感染的雞腎原代細(xì)胞(PCKs)中逸出，提示宿主體內(nèi)可能存在著一條通過誘導(dǎo)胞內(nèi)病原逸出介導(dǎo)的清除胞內(nèi)病原的免疫途徑 (Dongetal., 2011)。因此，闡明艾美耳球蟲的逸出機(jī)制不僅可以明晰球蟲的致病機(jī)理，而且可以為明確逸出介導(dǎo)的機(jī)體胞內(nèi)病原清除途徑提供更加可靠的證據(jù)。

在弓形蟲逸出的研究中，乙醇是一種重要的、常見的誘導(dǎo)工具 (Arrizabalagaetal., 2004)。本研究以乙醇作為逸出誘導(dǎo)劑對(duì)球蟲子孢子逸出的機(jī)制進(jìn)行了初步解析，為今后對(duì)于該過程機(jī)制的進(jìn)一步研究提供了有力的參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與蟲株

MDBK細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，于37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。穩(wěn)定表達(dá)黃色熒光蛋白 (YFP) 的轉(zhuǎn)基因柔嫩艾美耳球蟲EtM2e株由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建 (Liuetal., 2013)。

1.2 子孢子提取

柔嫩艾美耳球蟲EtM2e株孢子化卵囊用研磨器研磨至約90%卵囊破碎，3 000 r/ min離心8 min后用孢子囊消化液(10%雞膽汁，0.25%胰蛋白酶)按1×107個(gè)卵囊/毫升混勻并于42℃水浴鍋中作用30～50 min至90%子孢子釋放，2 500 r/min離心10 min洗去孢子囊消化液后加入DE-52纖維素柱中純化。收集到的子孢子用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)后用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.3 逸出實(shí)驗(yàn)

MDBK細(xì)胞培養(yǎng)于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入2×105個(gè)EtM2e株子孢子，培養(yǎng)12 h后用PBS緩沖液洗去未入侵的子孢子。用4%乙醇處理20 min或8%乙醇處理3 min后每孔抽取500 μL含有游離子孢子的培養(yǎng)基，利用EtM2e株子孢子穩(wěn)定表達(dá)的黃色熒光蛋白(YFP)為參數(shù)，流式細(xì)胞儀分析其中10 μL中所含的游離子孢子數(shù)量。

1.4 逸出阻斷實(shí)驗(yàn)

按前述方法洗去未入侵的子孢子后將培養(yǎng)基換成含有終濃度均為10 μmol/L的CytoD或BAPTA-AM(Sigma-Aldrich公司)培養(yǎng)基，37℃條件下孵育30 min，而后用8%乙醇作用3 min，逸出檢測(cè)方法如1.3所述。

1.5 微線體蛋白分泌誘導(dǎo)/阻斷實(shí)驗(yàn)

誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)：子孢子以2 500 r/min離心5 min，以6×107/mL濃度重懸于DMEM完全培養(yǎng)基中(90% DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清)，將待測(cè)樣品加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(46 μL/孔)，每孔分別加入4 μL無水乙醇或4 μL DMEM完全培養(yǎng)基于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3 min。作用后樣品以12 000 r/min于4℃條件下離心15 min分離上清與沉淀，兩部分均用于Western Blot檢測(cè)。

阻斷實(shí)驗(yàn)：子孢子在含有BATPA-AM(終濃度為10 μmol/L)的完全培養(yǎng)基中于37℃環(huán)境下作用30 min后用8%乙醇處理3 min，其余實(shí)驗(yàn)方法同誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。

1.6 柔嫩艾美耳球蟲Mic2蛋白(EtMic2)Western Blot檢測(cè)

將1.6所述上清和沉淀樣品進(jìn)行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。上清檢測(cè)組孵育的一抗為本實(shí)驗(yàn)室保存的抗EtMic2單抗，1∶200稀釋，二抗為HRP-羊抗小鼠IgG，1∶2 000稀釋；沉淀作為內(nèi)參孵育的一抗為抗黃色熒光蛋白多抗，1∶2 000稀釋，二抗為HRP-羊抗兔IgG，1∶2 000稀釋。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，各組數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用T檢驗(yàn)比較各組間數(shù)據(jù)差異，將P<0.05做為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 乙醇誘導(dǎo)柔嫩艾美耳球蟲子孢子從MDBK細(xì)胞中逸出

用4%乙醇處理感染子孢子的MDBK細(xì)胞20 min，收集含有游離子孢子的細(xì)胞培養(yǎng)液利用流式細(xì)胞儀分析。經(jīng)4%乙醇處理后，細(xì)胞培養(yǎng)液中的游離子孢子數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于未經(jīng)乙醇處理組(圖1-A)；將乙醇濃度提高至8%后，作用3 min便達(dá)到4%乙醇作用20 min的效果(圖1-B)。

圖1 乙醇可誘導(dǎo)柔嫩艾美耳球蟲子孢子從MDBK細(xì)胞中逸出Fig. 1 Ethanol could induce rapid egress of E. tenella sporozoites from infected MDBK cellsA: 4%乙醇誘導(dǎo)20 min 子孢子逸出情況；B: 8% 乙醇誘導(dǎo)3 min子孢子逸出情況。圖中所示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差。A: 4% ethanol for 20 min; B: 8% etahnol for 3 min. Each bar represents the mean with SEM (n=5).

2.2 子孢子的逸出過程與其運(yùn)動(dòng)能力相關(guān)

利用肌動(dòng)蛋白抑制劑CytoD處理感染子孢子的細(xì)胞充分抑制蟲體運(yùn)動(dòng)能力后，用8%乙醇處理細(xì)胞3 min。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果可以看出，與未用CytoD處理組相比，經(jīng)CytoD處理后的子孢子在乙醇誘導(dǎo)下逸出的能力顯著下降(圖2)。

圖2 細(xì)胞松弛素D對(duì)逸出的影響檢測(cè)Fig.2 Determination of the effect of cytochalasin D on rapid egress of sporozoites圖中所示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差；“+”表示加入該種試劑，“﹣”表示無該種試劑作用。Each bar represents the mean with SEM (n =6).

圖4 蟲體內(nèi)鈣離子對(duì)子孢子的逸出起關(guān)鍵作用Fig. 4 Intracellular Ca2+ of the parasite plays a vital function to egressA: 子孢子感染的MDBK細(xì)胞用終濃度為10 μmol/L的BAPTA-AM于37 ℃條件下孵育30 min后用8%乙醇作用3 min；B: 用8%乙醇處理10 μmol/L BAPTA-AM孵育30 min后的子孢子。A: Intracellular sporozoites were treated with 8% ethanol for 3 min either in the presence or absence of 10 μmol/L BAPTA-AM for 30 min. Each bar represents the mean with SEM (n=4); B: Free sporozoites were treated with 8% ethanol for 3 min at 37 ℃ either in the presence or absence of 10 μmol/L BAPTA-AM for 30 min.

2.3 乙醇可誘導(dǎo)子孢子微線體蛋白的大量分泌

微線體蛋白的分泌量與頂復(fù)門原蟲的運(yùn)動(dòng)能力呈現(xiàn)相關(guān)性，在剛地弓形蟲逸出的研究中常以微線體蛋白的分泌指示逸出現(xiàn)象的發(fā)生。本研究選擇EtMic2蛋白來反映蟲體在乙醇刺激下微線體的活動(dòng)情況。通過Western Blot結(jié)果可以看出，經(jīng)8%乙醇處理后子孢子EtMic2蛋白發(fā)生大量分泌(圖3)。

圖3 乙醇可誘導(dǎo)蟲體微線體蛋白的分泌Fig 3 Ethanol could stimulate the discharge of microneme from sporozoites以沉淀中蟲體表達(dá)的黃色熒光蛋白作為內(nèi)參。Sporozoites expressing YFP from parasites whole-cell lysate was used as a control.

2.4 蟲體內(nèi)Ca2+在逸出過程中起關(guān)鍵作用

使用內(nèi)源性Ca2+阻斷劑BAPTA-AM作用感染子孢子的細(xì)胞后，用8%乙醇處理被感染的細(xì)胞3 min。與未被阻斷的子孢子相比，Ca2+阻斷后子孢子在乙醇誘導(dǎo)下的逸出能力完全喪失(P<0.01)；同時(shí),蟲體內(nèi)Ca2+被阻斷后蟲體在乙醇誘導(dǎo)下微線體蛋白的分泌能力完全受到抑制(圖4)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)乙醇誘導(dǎo)的子孢子逸出與蟲體肌動(dòng)蛋白介導(dǎo)的蟲體運(yùn)動(dòng)相關(guān)，蟲體發(fā)生逸出時(shí)伴隨微線體蛋白的大量分泌，更重要的發(fā)現(xiàn)是上述過程均受到蟲體內(nèi)Ca2+的直接調(diào)控。上述研究結(jié)果填補(bǔ)了球蟲子孢子逸出機(jī)制研究的空白，初步建立了子孢子逸出研究的模型，為今后的進(jìn)一步研究提供了重要的參考。

頂復(fù)門原蟲逸出過程需要多種蟲體蛋白的參與，例如微線體蛋白的分泌會(huì)大量增加。弓形蟲微線體蛋白2(TgMic2)在自然逸出或是乙醇刺激的情況下分泌量顯著增加 (Nagamuneetal., 2008a)。本研究得到類似結(jié)果，即以球蟲微線體蛋白 EtMic2釋放作為標(biāo)準(zhǔn)指示逸出的發(fā)生，結(jié)果顯示在未經(jīng)刺激的情況下無法檢測(cè)到EtMic2的分泌，而當(dāng)8%乙醇誘導(dǎo)3 min后該蛋白的分泌量明顯升高，說明該蛋白可指示子孢子逸出的發(fā)生。因此，該發(fā)現(xiàn)也提示我們可以將EtMic2作為艾美耳球蟲在逸出的體內(nèi)研究中的一個(gè)重要候選標(biāo)記物。

本研究利用乙醇為工具初步闡明了Ca2+在艾美耳球蟲子孢子逸出中的作用和重要性。相關(guān)研究表明弓形蟲逸出依賴于蟲體胞漿內(nèi)Ca2+的瞬間升高，這些Ca2+來源于蟲體內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (Melzeretal., 2008)；通過鈣離子載體A13287人為將弓形蟲內(nèi)Ca2+濃度迅速升高可導(dǎo)致多種微線體蛋白的大量分泌 (Carruthersetal.,1999), 而在蟲體內(nèi)原性Ca2+被螯合的情況下分泌則完全受阻 (Nagamuneetal., 2008b)。有關(guān)瘧原蟲的研究發(fā)現(xiàn)Ca2+在其的逸出過程中同樣起到關(guān)鍵作用：提高宿主細(xì)胞亦或是蟲體自身Ca2+濃度均能導(dǎo)致惡性瘧原蟲Plasmodiumfalciparum裂殖子從紅細(xì)胞中快速逸出 (Chandramohanadasetal., 2009; Cruzetal., 2011)；而在逸出過程中微線體的分泌則必須依賴蟲體自身Ca2+濃度的升高 (Gargetal., 2013)。這兩種頂復(fù)門原蟲的模式生物Ca2+與逸出關(guān)系的研究與本研究基本相似，這提示我們Ca2+在頂復(fù)門原蟲逸出過程中的作用可能具有保守性。

綜上所述，本研究初步剖析了柔嫩艾美耳球蟲逸出的機(jī)制，為進(jìn)一步明確球蟲致病的分子機(jī)制提供了新的研究方向，并為研發(fā)新型抗球蟲藥物和高效球蟲疫苗提供了一定的科學(xué)依據(jù)。