余婉蓉,班萬里,王冰潔,潘星羽,幕永輝,劉 帥,吾力江·卡馬力,徐 晶,喻昌盛,趙 莉*,張壯志*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052;2.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所 新疆畜牧科學(xué)院動物臨床醫(yī)學(xué)研究中心,新疆烏魯木齊 830013;3.昌吉市動物疾病預(yù)防控制中心,新疆昌吉 831100)

棘球蚴病是由棘球絳蟲的中絳期幼蟲引起的一種人獸共患病,在我國以細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus,Eg)和多房棘球絳蟲(Echinococcusmultilocularis,Em)為主要病原[1,2]。犬既是細(xì)粒棘球絳蟲傳播的終末宿主,也是細(xì)粒棘球蚴病(包蟲病)的主要傳染源。我國是棘球蚴病的高發(fā)國家,其中以新疆、青海、西藏、四川等牧區(qū)發(fā)病率較高[3]。Zhang W等利用差異顯著PCR篩選出3個成熟蟲體與非成熟蟲體差異表達(dá)的基因,即EgM家族基因(EgM4、EgM9、EgM123)[4],構(gòu)建EgM4、EgM9、EgM123基因的原核表達(dá)載體,表達(dá)純化蛋白,進(jìn)行免疫試驗(yàn),然后開展人工感染試驗(yàn),結(jié)果顯示EgM9最為顯著,保護(hù)率達(dá)到97%～100%[5-9],效果最明顯,說明EgM家族基因?qū)?xì)粒棘球絳蟲終末宿主具有較好的免疫原性[10-11]。原核表達(dá)EgM9蛋白接種犬能明顯減少犬體內(nèi)細(xì)粒棘球絳蟲成蟲的數(shù)量和抑制蟲體發(fā)育,說明EgM9基因可能與細(xì)粒棘球絳蟲的成熟和卵的發(fā)育有關(guān),但其具體作用機(jī)制尚不清楚[12]。論文通過表達(dá)純化EgM9重組蛋白,免疫新西蘭大白兔獲得高免血清,在體外培養(yǎng)模型上,將高免血清作用于體外培養(yǎng)蟲體,觀察體外培養(yǎng)蟲體的發(fā)育狀況,通過Western blot檢測蟲體蛋白的免疫反應(yīng),通過RT-qPCR分析共培養(yǎng)蟲體EgM9基因的表達(dá)情況,探索EgM9在蟲體發(fā)育中的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蛋白、血清及蟲體 pET30a-EgM9重組蛋白、EgM9高免鼠血清由國家動物包蟲病參考實(shí)驗(yàn)室(新疆畜牧科學(xué)獸醫(yī)研究所)提供;細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴采集于烏魯木齊市華凌屠宰場。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 新西蘭大白兔2只,雌性,2 kg,購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.1.3 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)液,青霉素-鏈霉素混合液,美國Hyclone公司產(chǎn)品;胎牛血清,美國BI公司產(chǎn)品;羊抗鼠IgG-RP,驢抗兔IgG-HRP,美國Thermo公司產(chǎn)品;脫脂奶粉,美國BD公司產(chǎn)品;弗氏完全佐劑,不完全佐劑,亞甲藍(lán)、胃蛋白酶,?；悄懰猁}T4009,美國Sigma公司產(chǎn)品;RNA提取試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品;第一鏈cDNA合成Master Mix(去基因組DNA)反轉(zhuǎn)錄試劑盒,江蘇康為試劑生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 生物安全柜(SW-CJ-SFD),上海博訓(xùn)實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品;37℃ CO2培養(yǎng)箱(HF212),上海力申科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;恒溫水浴鍋(F12),德國Julabo公司產(chǎn)品;倒置顯微鏡(XDS-2000C),上海蔡康光學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;全波長酶標(biāo)儀(Infinite F50),瑞士TECAN帝肯公司產(chǎn)品;蛋白電泳儀(PAC3000),美國Bio-Rad公司產(chǎn)品;半干轉(zhuǎn)印儀(221BR 47894),美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 高免兔血清的制備 將純化過的重組蛋白pET-30a-EgM9與弗氏完全佐劑(首免)或弗氏不完全佐劑(二免、三免)等體積混合乳化,免疫新西蘭大白兔。每次免疫間隔2周,首次免疫劑量為100 μg/只,之后免疫劑量為50 μg/只,每次免疫前進(jìn)行耳緣靜脈采血,收集血清備用。

1.2.2 ELISA檢測血清效價 將純化過的pET-30a-EgM9重組蛋白稀釋成終濃度為3 μg/mL進(jìn)行包被,以1.2.1制備的兔血清作為一抗,以驢抗兔IgG-HRP(1∶8 000)為二抗,采用間接ELISA法測定免疫后的血清效價;期間定期檢測血清效價,血清效價下降則繼續(xù)進(jìn)行加免,收集1∶80 000以上的血清備用。

1.2.3 原頭蚴的采集及體外培養(yǎng) 將采集回的患病羊肝臟用蒸餾水將表面清洗干凈,用75%乙醇對表面進(jìn)行消毒,吸出囊液,濾液置于50 mL離心管中自然沉淀。將沉淀物置于平皿中,用含雙抗的生理鹽水反復(fù)清洗其中的原頭蚴,至液體澄清無雜質(zhì)。將清洗好的原頭蚴按照1∶10加入1%胃蛋白酶溶液,37℃水浴鍋中消化30 min,待原頭蚴自然沉淀,用含有雙抗的生理鹽水清洗3～4遍,洗去活力弱的原頭蚴和未消化完全的組織碎片,吸取2 μL的原頭蚴用0.1%亞甲基藍(lán)測其活力,活力>99%可用于培養(yǎng)。將4 000～5 000枚原頭蚴加入到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,加入含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中,放入37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),觀察有無污染,后每隔2 d換一次液,換液前后觀察原頭蚴的狀態(tài),待用。

1.2.4 高免兔血清作用于體外培養(yǎng)30 d蟲體 將免疫前血清與高免血清經(jīng)0.22 μm濾膜過濾,分裝備用。將體外培養(yǎng)30 d的蟲體按每孔150～200條培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板中,試驗(yàn)分3組,Ⅰ組為空白對照組,Ⅱ組為添加20%免疫前血清作用于體外培養(yǎng)蟲體,Ⅲ組為添加20%高免血清作用于體外培養(yǎng)蟲體。每日觀察,在第6天拍照觀察記錄免疫前血清和高免血清對體外培養(yǎng)30 d蟲體發(fā)育情況的影響,0.1%亞甲基藍(lán)染色著色為死蚴,不著色為活蚴。計算每孔原頭蚴死亡率(%),死亡率(%)=(死亡數(shù)/原頭蚴總數(shù))×100%。

1.2.5 SDS-PAGE、Western blot鑒定蟲體蛋白的免疫反應(yīng)性 試驗(yàn)分5組,前3組同上,Ⅳ組為自然感染原頭蚴(PSC);Ⅴ組為自然感染細(xì)粒棘球絳蟲成蟲蟲體,經(jīng)超聲破碎提取蟲體蛋白。

1.2.5.1 直接ELISA法 用BCA試劑盒測定上述5組蟲體蛋白濃度,經(jīng)12% SDS-PAGE分離蟲體蛋白,7 V、 2 h轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜(NC膜),5%脫脂奶粉4℃封閉過夜,加入驢抗兔二抗IgG-HRP室溫孵育1 h,用4-氯-1-萘酚進(jìn)行顯色成像儀進(jìn)行拍照分析。

1.2.5.2 間接ELISA法 Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組蟲體蛋白和純化的EgM9蛋白,轉(zhuǎn)NC膜后,5%脫脂奶粉4℃封閉過夜,加入EgM9高免鼠血清室溫孵育1 h,加入羊抗鼠IgG-RP室溫孵育1 h,用4-氯-1-萘酚進(jìn)行顯色成像儀進(jìn)行拍照分析。

1.2.6 RT-qPCR鑒定體外培養(yǎng)蟲體EgM9基因表達(dá)狀況 根據(jù)陳云英[13]細(xì)粒棘球絳蟲體外不同發(fā)育時期EgM9基因差異表達(dá)研究中設(shè)計的引物,根據(jù)RNA提取試劑盒提?、窠M、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組蟲體的RNA,根據(jù)第一鏈cDNA合成Master Mix(去基因組DNA)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,測定cDNA濃度后進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL,其中Mix 10 μL、上游引物0.8 μL、下游引物0.8 μL、模板1 μL、RNA free dd H2O 7.4 μL;PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性3 min;95℃變性3 s,65℃退火30 s,共40個循環(huán),每個樣本重復(fù)3次,得出熔解曲線。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 熒光定量PCR結(jié)果根據(jù)2-△△CT計算目的基因相對表達(dá)水平,根據(jù)SPSS軟件進(jìn)行多因素方差分析,以P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白純化

SDS-PAGE結(jié)果表明pET-30a-EgM9重組蛋白大小為19.8 ku,與預(yù)期目的條帶一致(圖1)。Western blot試驗(yàn)結(jié)果表明,pET-30a-EgM9重組蛋白能被高免兔血清識別,且條帶單一,有很好的免疫原性(圖2)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1,2.未純化前重組蛋白pET-30a-EgM9;3.純化后重組蛋白pET-30a-EgM9

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.重組蛋白pET-30a-EgM9

2.2 pET-30a-EgM9重組蛋白免疫兔后血清抗體效價檢測

通過間接ELISA法檢測兔血清中的抗體水平,結(jié)果顯示,首免后EgM9重組蛋白誘導(dǎo)兔產(chǎn)生的IgG抗體水平變化小,但在第2次免疫后水平急劇升高,第3次免疫后又稍有上升,后抗體水平在加強(qiáng)免疫下,抗體水平持續(xù)維持在OD450≥2.30左右。

2.3 高免血清對體外培養(yǎng)30 d蟲體發(fā)育的影響

高免兔血清作用于體外培養(yǎng)Eg30 d的蟲體開展體外干預(yù)試驗(yàn),第6天時,經(jīng)0.1%亞甲基藍(lán)染色,觀察到的蟲體死亡情況如下,Ⅰ組蟲體死亡率為9.0%±1.769%,Ⅱ組蟲體的死亡率為12.9%±1.718%,Ⅲ組蟲體的死亡率為14.28%±2.96%。通過SPSS軟件對3組蟲體的死亡率進(jìn)行方差分析結(jié)果得出P>0.05,表明3個組之間體外培養(yǎng)蟲體的死亡率沒有差異,但是Ⅲ組蟲體蟲體體節(jié)縮短,往成囊方向發(fā)展,蟲體培養(yǎng)液中有許多脫落的頭節(jié)小鉤碎片。

2.4 SDS-PAGE、Western blot鑒定免疫反應(yīng)性

2.4.1 SDS-PAGE、Western blot直接法鑒定免疫反應(yīng)性 Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組蟲體蛋白經(jīng)過SDS-PAGE分離見圖3A,從圖中可以看出各組蟲體蛋白帶型基本相似,經(jīng)過Western blot分析(圖3B),Ⅰ組、Ⅳ組、Ⅴ組蟲體蛋白未見條帶Ⅱ組Ⅲ組蟲體蛋白在51 ku～62 ku處有明顯條帶見,且Ⅲ組蟲體蛋白的條帶最明顯,顏色更深特異性更強(qiáng)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.Ⅳ組蟲體蛋白;2.Ⅴ組蟲體蛋白;3.Ⅰ組蟲體蛋白;4.Ⅲ組蟲體蛋白;5.Ⅱ組蟲體蛋白M.Protein molecular weight Marker; 1-5.The proteins of Ⅳ,Ⅴ,Ⅰ,Ⅲ,Ⅱ groups

2.4.2 SDS-PAGE、Western blot間接法鑒定免疫反應(yīng)性 Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組蟲體蛋白與EgM9蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離見圖4A,經(jīng)Western blot分析Ⅰ組,Ⅱ組、Ⅴ組蟲體蛋白及EgM9蛋白在22 ku～29 ku處有明顯條帶(圖4B),且EgM9蛋白的條帶顏色更深,而Ⅲ組和Ⅳ組蟲體蛋白未出現(xiàn)條帶。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.Ⅰ組蟲體蛋白;2.Ⅱ組蟲體蛋白;3.Ⅴ組蟲體蛋白;4.Ⅳ組蟲體蛋白;5.Ⅲ組蟲體蛋白;6.EgM9重組蛋白M.Protein molecular weight Marker; 1-5.The proteins ofⅠ,Ⅱ,Ⅴ,Ⅳ,Ⅲ groups; 6.EgM9 protein

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析RT-qPCR結(jié)果

熒光定量PCR結(jié)果經(jīng)2-△△CT計算EgM9基因的表達(dá)差異,根據(jù)SPSS軟件進(jìn)行方差分析Ⅳ組蟲體與Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組蟲體的EgM9基因表達(dá)量差異極顯著(P<0.01),且Ⅲ組蟲體的EgM9基因表達(dá)量最高,與Ⅰ組、Ⅱ組蟲體的EgM9基因表達(dá)量差異極顯著(P<0.01)。

表1 qPCR經(jīng)2-△△CT計算EgM9基因的表達(dá)結(jié)果

3 討論

1994年Heath D D就利用六鉤蚴作為抗原免疫羊,獲得的抗血清通過親和純化分出5個蛋白區(qū)域的抗體,分別在體外與六鉤蚴培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)小于20 ku和23 ku～25 ku蛋白質(zhì)制備的抗體均能殺死六鉤蚴[14-15]。David 發(fā)現(xiàn)Eg95的抗血清對六鉤蚴的殺死率達(dá)到 99.8%[16]。本研究通過pET-30a-EgM9重組蛋白免疫新西蘭大白兔,獲得高免血清,細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴經(jīng)體外培養(yǎng)30 d后加入免疫前兔血清(Ⅱ組)和抗pET30a-EgM9重組蛋白高免兔血清(Ⅲ組)作用于體外培養(yǎng)細(xì)粒棘球絳蟲蟲體。結(jié)果發(fā)現(xiàn),試驗(yàn)組Ⅱ組、Ⅲ組體外培養(yǎng)蟲體的死亡率與Ⅰ組(空白對照組)蟲體死亡率無顯著性差異,與趙莉[17]等EgM123重組蛋白抗血清對多房棘球絳蟲殺傷結(jié)果不同,造成其原因可能應(yīng)為所選取的體外培養(yǎng)蟲體的天數(shù)不同,本次選取的是體外培養(yǎng)30 d的蟲體,隨著體外培養(yǎng)時間的延長,可能蟲體發(fā)育系統(tǒng)更為成熟,抵御外界環(huán)境的刺激能力更強(qiáng)。Western blot直接法中,蟲體蛋白與驢抗兔二抗IgG-HRP直接反應(yīng),結(jié)果顯示,Ⅱ組和Ⅲ組有條帶,且Ⅲ組(加入20%高免兔血清共培養(yǎng)組)的反應(yīng)更加清晰,出現(xiàn)特異性條帶,說明pET-30a-EgM9重組蛋白高免兔血清可以通過某種形式進(jìn)入體外培養(yǎng)蟲體體內(nèi)和細(xì)粒棘球絳蟲的蟲體蛋白形成復(fù)合體。間接法中通過加入pET-30a-EgM9重組蛋白高免鼠血清,結(jié)果顯示,Ⅴ組蟲體蛋白出現(xiàn)了特異性條帶,而Ⅳ組(PSC)不出現(xiàn)條帶,驗(yàn)證了Zhang W B[10]等EgM9蛋白是成蟲特有蛋白,表明EgM9可以作為疫苗候選基因進(jìn)行研究。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅳ組、蟲體蛋白及EgM9重組蛋白出現(xiàn)特異性條帶,而Ⅲ組(加入20%高免兔血清共培養(yǎng)組)未出現(xiàn)條帶,表明EgM9抗原表位可能被高免兔血清中抗體占據(jù),所以在加入高免鼠血清進(jìn)行抗原表位識別時,未出現(xiàn)特異性條帶。陳云英[13]等人通過對體外培養(yǎng)原頭蚴各個階段的蟲體EgM9基因之間的表達(dá)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),EgM9基因隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而增加。本研究通過對原頭蚴和體外培養(yǎng)30 d蟲體的EgM9基因表達(dá)差異進(jìn)行分析比較驗(yàn)證了這一結(jié)論。Ⅲ組的EgM9表達(dá)量最高,其原因可能是高免血清中的EgM9抗體可以刺激蟲體EgM9抗原的產(chǎn)生,從而導(dǎo)致EgM9基因表達(dá)水平升高。綜上所述,pET-30a-EgM9重組蛋白高免兔血清通過與體外培養(yǎng)30 d蟲體共培養(yǎng),EgM9抗體可以結(jié)合蟲體中EgM9的表達(dá)蛋白,且形成復(fù)合物,進(jìn)而證實(shí)了EgM9基因是蟲體性成熟發(fā)育的調(diào)控基因之一。