汪運(yùn)舟 陶鴿如 崔玉娟 李 超 王 丹 焦雅清索 勛 劉賢勇

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

兔艾美耳球蟲是一類專性寄生于兔消化系統(tǒng)的寄生原蟲，能夠引起嚴(yán)重的兔球蟲病。當(dāng)前兔球蟲共有11個(gè)有效種，各個(gè)種之間致病性存在較大的差異，對(duì)兔群的危害程度也不盡相同。因此有效的蟲種鑒別，對(duì)評(píng)估球蟲病暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)有著十分重要的意義。

傳統(tǒng)兔球蟲的檢測(cè)方法主要是利用飽和食鹽水漂浮觀察糞便中球蟲卵囊，根據(jù)形態(tài)學(xué)差異進(jìn)行蟲種區(qū)分(Pakandl, 2009)；隨著PCR技術(shù)的應(yīng)用，對(duì)蟲種間高度特異的靶基因進(jìn)行檢測(cè)，可以更加靈敏準(zhǔn)確地鑒定球蟲種類。Oliveira等(2011)利用11種兔球蟲ITS序列設(shè)計(jì)特異性引物，從而建立了能夠區(qū)分11個(gè)兔球蟲種的PCR檢測(cè)方法；Yan等(2013)建立了兔球蟲多重PCR檢測(cè)技術(shù)，可以對(duì)多個(gè)高致病性蟲種進(jìn)行鑒定。但是PCR檢測(cè)需要一定量的卵囊制備DNA模板，當(dāng)樣品中卵囊含量較少時(shí)，制備的基因組含量不易達(dá)到PCR檢測(cè)的閾值，使其應(yīng)用受到了限制。因此提高檢測(cè)的靈敏度，克服卵囊數(shù)量少的阻礙，對(duì)于該技術(shù)在田間檢測(cè)中更廣泛的應(yīng)用有著重要意義(Barbaraetal., 2008)。

當(dāng)前全基因組擴(kuò)增技術(shù)(Whole genome amplification，WGA)能夠?qū)ξ⒘繕悠分械腄NA進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增，擴(kuò)大初始模板，提高PCR的靈敏度和檢測(cè)的成功率(Hawkinsetal., 2002)?；谠摷夹g(shù)，我們建立了兔球蟲單卵囊PCR技術(shù)，能夠在單個(gè)卵囊的水平上進(jìn)行蟲種鑒定，從而大大提高PCR反應(yīng)的靈敏度(Wangetal., 2014)。因此，將該技術(shù)應(yīng)用于田間樣品的檢測(cè)有著較大的可行性。

本研究對(duì)田間樣品卵囊裂解過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，引入WGA技術(shù)處理制備后的基因組模板，以提高后續(xù)PCR反應(yīng)的靈敏度，最后通過(guò)對(duì)田間樣品的檢測(cè)，驗(yàn)證優(yōu)化后的方法在田間樣品檢測(cè)中的可應(yīng)用性。

1 材料與方法

1.1 卵囊樣品

用于驗(yàn)證裂解方法的卵囊：實(shí)驗(yàn)室保存的斯氏艾美耳球蟲Eimeriastiedai張家口分離株。田間樣品為實(shí)驗(yàn)室保存的采集自河北省多家新西蘭白兔養(yǎng)殖場(chǎng)的兔糞樣品。

1.2 卵囊裂解液

取10% 的SDS溶液溶液，用無(wú)菌去離子水倍比稀釋，使終濃度分別為0.01%、0.1%和1%，作為卵囊裂解液；蛋白酶K(10 mg/mL)購(gòu)自德國(guó)默克公司。

1.3 單卵囊的分離與裂解

取斯氏艾美耳球蟲卵囊，利用倍比稀釋法稀釋至約1～2個(gè)/μL。將卵囊懸液滴至0.5 cm×0.5 cm的透析膜上，用鑷子將帶有卵囊的透析膜移入含有5 μL卵囊裂解液(0.01%、0.1%或1%SDS)的PCR管中；將PCR管置于液氮中反復(fù)凍融5次，之后加入0.5 μL蛋白酶K(20 mmol/L)，55℃孵育2 h，95℃孵育30 min以滅活蛋白酶K。同時(shí)驗(yàn)證化學(xué)裂解和不同方法單獨(dú)處理后的裂解效果，不同裂解程序見(jiàn)表1，通過(guò)對(duì)裂解處理樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，確定最佳裂解方法。

1.4 田間樣品的純化

本研究所用的田間樣品中卵囊含量較低，低于或接近麥克馬斯特計(jì)數(shù)法的檢測(cè)閾值(每毫升不足100個(gè)卵囊)，因此須先用飽和鹽水濃集法對(duì)卵囊進(jìn)行富集。取田間糞便樣品混液1 mL，3 600 r/min離心5 min，棄去上清；沉淀中加入飽和食鹽水，重懸，3 600 r/min離心5 min，用移液器吸取含卵囊的上清移至另一離心管中；加入約5倍體積的無(wú)菌雙蒸水，3 600 r/min離心5 min，棄去上清；沉淀即為樣品中卵囊。沉淀用5 μL卵囊裂解液(SDS)重懸后進(jìn)行裂解處理，方法見(jiàn)1.3。樣品卵囊用于PCR檢測(cè)前進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.5 全基因組擴(kuò)增

卵囊裂解產(chǎn)物進(jìn)行全基因組擴(kuò)增。向卵囊裂解產(chǎn)物中加10×Phi29 DNA 聚合酶緩沖液1 μL，隨機(jī)引物(100 μmol/L)2.5 μL，95℃加熱3 min，立即置于冰上冰浴15 min；加入0.5 μL dNTP(10 mmol/L)，0.5 μL 100 ×BSA，0.5 μL Phi 29 DNA聚合酶(10 U/μL，NEB公司)，30℃溫育過(guò)夜；過(guò)夜產(chǎn)物65℃溫育10 min，使Phi 29 DNA聚合酶失活；取1 μL 上述全基因擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.6 ITS-1序列的擴(kuò)增

兔球蟲屬特異性和種特異性ITS-1序列引物根據(jù)Oliveira(2011)報(bào)道進(jìn)行合成。實(shí)驗(yàn)前將所有11對(duì)引物序列與NCBI已知各蟲種ITS-1序列進(jìn)行比對(duì)，確定各對(duì)特異性引物僅能與特定序列結(jié)合，而不能與其他蟲種ITS-1序列結(jié)合，具有良好的特異性。選用巢式PCR進(jìn)行檢測(cè)，首先將全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物取1 μL作為模版，利用兔球蟲屬特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再以第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1 μL作為模板進(jìn)行種特異性引物擴(kuò)增。兩輪PCR擴(kuò)增體系與程序相同，擴(kuò)增體系為：上下游特異性引物各0.5 μL(25 μmol/L)，2×Taq Mix 12.5 μL(CwBio)，ddH2O 10.5 μL，模板1 μL；反應(yīng)體系為94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共計(jì)25個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，特異性條帶回收后測(cè)序，結(jié)果與NCBI已報(bào)道的兔球蟲ITS-1序列進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 兔球蟲PCR檢測(cè)方法的優(yōu)化

根據(jù)表1的不同方法，我們對(duì)單個(gè)斯氏艾美耳球蟲卵囊進(jìn)行了裂解，裂解產(chǎn)物進(jìn)行WGA擴(kuò)增后用于PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示結(jié)合液氮凍融、0.01% SDS和蛋白酶K消化的方法能夠有效裂解卵囊釋放基因組，處理后的產(chǎn)物能夠成功進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖1)；而使用其他方法，則因?yàn)榱呀獠怀浞只蛘哂幸种芇CR成分而擴(kuò)增效果不佳(表1)。利用優(yōu)化后的裂解方法，我們對(duì)10個(gè)斯氏艾美耳球蟲單個(gè)卵囊進(jìn)行了擴(kuò)增，PCR后均獲得相應(yīng)大小的條帶，測(cè)序結(jié)果顯示擴(kuò)增成功(圖2)。結(jié)果表明利用優(yōu)化后的裂解方法，結(jié)合WGA技術(shù)對(duì)卵囊模板進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增能夠保證基因組模板的含量，可在單個(gè)卵囊的水平上進(jìn)行蟲種鑒定，體現(xiàn)了較高的靈敏度。

2.2 田間樣品的PCR檢測(cè)

對(duì)10份田間樣品，我們首先進(jìn)行了鏡檢，通過(guò)形態(tài)學(xué)特征對(duì)其中的卵囊種類進(jìn)行判斷。之后利用優(yōu)化后的方法，進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示10份樣品的PCR擴(kuò)增均獲成功，圖3為其中一份卵囊樣品的PCR檢測(cè)結(jié)果。各蟲種特異性引物所對(duì)應(yīng)泳道中出現(xiàn)的條帶大小其對(duì)應(yīng)大小相吻合；我們選取11份代表各蟲種的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明各種特異性引物所對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物序列，均為其所對(duì)應(yīng)的蟲種，序列比對(duì)后相似性均大于97%，證明PCR方法成功鑒定了樣品中所含蟲種。10份樣品的成功檢測(cè)表明了優(yōu)化后的PCR檢測(cè)方法能夠用于田間卵囊含量較少的樣品檢測(cè)。

表 1 不同裂解方法以及效果Tab. 1 The comparison of the effect with different lysis methods

注：++ 代表成功擴(kuò)增，+代表部分能夠擴(kuò)增，— 代表擴(kuò)增失敗。

Note: ++ represents fully successful amplification, + represents partially successful amplification, — represents negative amplification.

圖1 不同裂解方法裂解后斯氏艾美耳球蟲PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 PCR detection results of E. stiedai with single oocyst after different lysis methods1～6: 不同裂解方法(表1)裂解后獲得DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)的電泳結(jié)果; 7: 為陰性對(duì)照; M：DNA marker D2000 plus。1-6: Individual PCR product after different lysis methods (Tab. 1); 7: Negative control; M：DNA marker D2000 plus.

圖2 斯氏艾美耳球蟲單卵囊PCR檢測(cè)結(jié)果Fig. 2 Single oocyst PCR detection results of E. stiedaiwith single oocyst1～10: 10個(gè)斯氏艾美耳球蟲單卵囊PCR擴(kuò)增產(chǎn)物; 11: 陽(yáng)性對(duì)照；M：DNA marker D2000 plus；12 ：陰性對(duì)照。1-10: Ten single oocyst PCP product of E. stiedai individually；11: Positive control; M: DNA marker D2000 plus; 12: Negative control.

2.3 形態(tài)學(xué)觀察與PCR檢測(cè)結(jié)果比較

對(duì)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果與PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，樣品中形態(tài)學(xué)鑒定出的蟲種都可以應(yīng)用PCR方法檢測(cè)確認(rèn)，符合率100%(表2)；其中有6份田間樣品中含有大量未孢子化的卵囊，因此無(wú)法從外殘?bào)w、卵膜孔的特征等方面進(jìn)行具體的蟲種鑒定，因此依據(jù)PCR鑒定的方法對(duì)其蟲種進(jìn)行了判定?？傮w來(lái)看，對(duì)于樣品中形態(tài)特征明顯的蟲種檢測(cè)呈現(xiàn)了良好的一致性，對(duì)于不易判斷的蟲種，PCR檢測(cè)給予更為可靠的檢測(cè)結(jié)果。

表2 田間樣品形態(tài)學(xué)與PCR檢測(cè)結(jié)果對(duì)比Tab. 2 Comparison between morphological and PCR identification

E.mag：大型艾美耳球蟲；E.med：中型艾美耳球蟲；E.int：腸艾美耳球蟲；E.vej：維氏艾美耳球蟲；E.sti：斯氏艾美耳球蟲；E.per：穿孔艾美耳球蟲；E.coe：盲腸艾美耳球蟲；E.irr：無(wú)殘艾美耳球蟲；E.pir：梨形艾美耳球蟲；E.exig：小型艾美耳球蟲；E.fla：黃艾美耳球蟲?！?”：有；—：無(wú)；“/”前為PCR鑒定結(jié)果，后為形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果。

PCR identification showed before the mark‘/’, while morphological identification after ‘/’;‘+’: positive; ‘—’: negative.

圖3 田間樣品的PCR檢測(cè)結(jié)果Fig. 3 PCR detection results of ten field samples1：大型艾美耳球蟲；2：維氏艾美耳球蟲；3：腸艾美耳球蟲；4：穿孔艾美耳球蟲；5：中型艾美耳球蟲；6：斯氏艾美耳球蟲；7：盲腸艾美耳球蟲；8：無(wú)殘艾美耳球蟲；9：梨形艾美耳球蟲；10：小型艾美耳球蟲；11：黃艾美耳球蟲；M：DNA marker D2000 plus。1: E. magna; 2: E. vejdovskyi; 3: E. intestinalis; 4: E. perforans; 5: E. media; 6: E. stiedai; 7: E. coecicola; 8: E. irresidua; 9: E. piriformis; 10: E. exigua; 11: E. flavescens; M: DNA Marker D 2000 plus.

3 討論

兔球蟲的蟲種有11個(gè)之多，進(jìn)行準(zhǔn)確的蟲種鑒定對(duì)于流行病學(xué)調(diào)查以及蟲株純度檢驗(yàn)有著十分重要的意義。本研究對(duì)PCR檢測(cè)方法進(jìn)行了改進(jìn)，通過(guò)優(yōu)化卵囊的裂解方法和引入WGA技術(shù)，提高PCR檢測(cè)的靈敏度，并以此成功地對(duì)卵囊含量較少的田間樣品進(jìn)行檢測(cè)。

田間樣品采集及鑒定常遇到待檢微生物含量較少、基因組提取過(guò)程中有所損失的問(wèn)題，導(dǎo)致達(dá)不到PCR的檢測(cè)閾值而呈假陰性結(jié)果(Lynnetal., 2009)。因此本研究將常見(jiàn)的裂解方法進(jìn)行組合，探索適于檢測(cè)的田間樣品的PCR模板快速制備方法。該體系中，液氮凍融和蛋白酶K(需滅活)的使用不會(huì)引入PCR反應(yīng)的抑制成分，是很好的裂解手段，但是由于單獨(dú)使用不能夠完全裂解卵囊，所以需要引入其他的輔助方法；而SDS作為一種陰離子去污劑，能夠破壞蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，而被廣泛的利用于蛋白質(zhì)的裂解，但是SDS的存在會(huì)影響PCR反應(yīng)的進(jìn)行(Wilson, 1997)，因此需要控制其使用濃度。試驗(yàn)中我們通過(guò)比較試驗(yàn)，表明了SDS的適用濃度為0.01%，能夠有效裂解卵囊且不抑制PCR反應(yīng)的進(jìn)行。利用上述裂解方法，能夠?qū)NA的獲取和后續(xù)反應(yīng)在同一PCR管中進(jìn)行，減少了模板在不同反應(yīng)空間內(nèi)的轉(zhuǎn)移次數(shù)，進(jìn)行有效避免了模板的損失。

田間樣品中卵囊含量少時(shí)難于提供足夠的檢測(cè)模板用于PCR反應(yīng)，因此很多樣品的檢驗(yàn)只能使用眼觀鏡檢的方法來(lái)確定，使蟲種鑒定的準(zhǔn)確性大大降低。因此有必要對(duì)田間樣品進(jìn)行有效的處理，以達(dá)到PCR反應(yīng)的閾值，利用全基因組擴(kuò)增技術(shù)正是克服模板含量低的有效方法(Deanetal., 2002)。我們已成功的將WGA技術(shù)應(yīng)用于兔球蟲基因組的擴(kuò)增，能夠在單個(gè)卵囊的水平上對(duì)ITS-1這一蟲種鑒定的重要序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增(Wangetal., 2014)。因此我們將WGA技術(shù)引入到田間蟲種鑒定中來(lái)。利用該方法，鑒定出了眼觀并未確認(rèn)的蟲種，證明了起在田間樣品檢測(cè)中應(yīng)用的可行性。因此該方法較傳統(tǒng)先提取基因組再進(jìn)行PCR檢測(cè)方法，更為靈敏；且準(zhǔn)確性較形態(tài)學(xué)觀察的方法大大提高。

綜上所述，我們通過(guò)探索卵囊的裂解方法和引入WGA技術(shù)，提高了PCR檢測(cè)手段在兔球蟲田間樣品檢測(cè)中的靈敏度，擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍，能夠成為有效的田間蟲種檢測(cè)手段。