任 超 趙世云 劉賢勇**

(1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院, 北京 100193; 2. 天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院, 天津 300384)

雞球蟲病是規(guī)?；B(yǎng)雞場最為常見的疫病之一，其流行率高、對雞生產(chǎn)性能危害大，每年給世界養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失(Blakeetal., 2014)。雞的7 種球蟲中，巨型艾美耳球蟲Eimeriamaxima寄生于小腸中段，具有強(qiáng)致病性 (Long, 1959; Johnsonetal., 1970)。而更讓人感興趣的是，免疫原性強(qiáng)是巨型艾美耳球蟲最顯著的特征之一——雞只免疫5個巨型艾美耳球蟲卵囊即可獲得針對同源蟲種的完全免疫保護(hù) (Leeetal., 1978; Blakeetal., 2012)。因此巨型艾美耳球蟲可作為研究家禽與病原互相作用及禽免疫學(xué)的理想蟲種。

血清中IgY含量的檢測可用于評價球蟲感染激發(fā)宿主產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答，而膽汁和空腸組織中sIgA含量的檢測則可反映球蟲感染激發(fā)宿主產(chǎn)生粘膜免疫應(yīng)答水平。細(xì)胞免疫反應(yīng)在機(jī)體抵抗胞內(nèi)寄生蟲感染中起到十分重要的作用。激活的CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ可以阻滯球蟲的再感染，且外源IFN-γ可以阻滯球蟲在細(xì)胞內(nèi)的發(fā)育，降低雞只排卵囊量 (Lillehojetal., 1998; Bourgeoisetal., 2002)。因此通過檢測分泌IFN-γ的脾臟淋巴細(xì)胞水平可以評價球蟲感染所激發(fā)的細(xì)胞免疫反應(yīng)情況。在本研究中，我們利用巨型艾美耳球蟲進(jìn)行3次間隔感染雞只，通過酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法等手段檢測抗體應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，從而反映其激發(fā)宿主產(chǎn)生的免疫應(yīng)答特征及免疫保護(hù)力，為巨型艾美耳球蟲的免疫原性解析提供更多的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：28日齡白來航SPF雞購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于禽用高效隔離器中，給以無球蟲的水和飼料，雞只自由采食。

1.1.2 蟲株：本實(shí)驗(yàn)中使用的巨型艾美耳球蟲北京株由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)國家動物寄生原蟲實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要試劑與試劑盒：HRP-Goat anti-Chicken IgY-Fab、HRP-Goat anti-Chicken IgA購自BETHYL公司；Hyclone RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Thermo-Fisher公司；LymphospotTM無血清培養(yǎng)基和All-IN-ONE Mouse ELISPOT Accessory Kit購自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；Chicken IFN-γ 試劑盒購自Invitrogen公司；PVDF板購自Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 巨型艾美耳球蟲感染：實(shí)驗(yàn)組與對照組各取25只雞，在30、42和52日齡進(jìn)行巨型艾美耳球蟲孢子化卵囊口服，感染劑量分別為5×102、5×103、5×104個/只，對照組為無球蟲感染的雞只。

1.2.2 ELISA檢測血清中的總IgY、膽汁和腸道中sIgA的滴度：根據(jù)免疫程序，在35、41、47、57日齡每組分別取5只雞進(jìn)行血清IgY、膽汁和腸道分泌型IgA水平的檢測。采集靜脈血分離血清；收集膽汁，1 mL/只；取雞的空腸，縱向切開，剪成1 cm的小段，放入腸間IgA提取液中，4 ℃搖床消化4 h，4 ℃離心2 000 g，30 min，收集上清，加入0.1 % BSA作為保護(hù)劑。用包被緩沖液將孢子化巨型艾美耳球蟲卵囊全抗原分別稀釋至4 μg/mL(檢測血清總IgY)、2 μg/mL(檢測膽汁中分泌型IgA)、8 μg/mL(檢測腸道中分泌型IgA)，100 μL/孔，置于4 ℃過夜；一抗，即被檢樣品的稀釋倍數(shù)分別為1∶400(血清)、1∶400(膽汁)、1∶8(腸道)，100 μL/孔，37 ℃濕盒孵育1 h，同時以健康無球蟲感染雞只的血清為陰性對照；HRP-Goat anti-Chicken IgY-Fab和HRP-Goat anti-Chicken IgA酶標(biāo)二抗的稀釋倍數(shù)均為1∶10 000，100 μL/孔，37 ℃濕盒孵育1 h；顯色液100 μL/孔，室溫避光反應(yīng)15 min，再加入終止液50 μL/孔，將ELISA反應(yīng)板放入酶標(biāo)儀中，讀取OD 450 nm/630 nm值。

1.2.3 ELISPOT檢測脾臟淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ水平：根據(jù)免疫程序，在35、47和57 日齡每組分別取5只雞，無菌分離并純化脾臟淋巴細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基避光條件下將細(xì)胞濃度調(diào)整至5×107個/mL。向PVDF板加入預(yù)濕液15 μL/孔，預(yù)濕10 min；扣去預(yù)濕液，加入Mouse-Anti-ChIFN-γ捕獲抗體(2 μg/mL)100 μL/孔進(jìn)行包板，4 ℃過夜；傾倒包被液，加入封閉液200 μL/孔，室溫封閉2 h；倒掉封閉液，加入脾臟淋巴細(xì)胞100 μL/孔，每個樣品做2個重復(fù)；加入孢子化巨型艾美耳球蟲卵囊全抗原(5 μg/mL)，并設(shè)立陰性對照(培養(yǎng)基)和陽性對照(植物血凝素，phytohaemagglutinin，PHA)，10 μL/孔；將PVDF板放入41 ℃ CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，倒掉培養(yǎng)基和細(xì)胞，加入冰冷的去離子水200 μL/孔，冰浴10 min；加入洗液200 μL/孔，洗滌10次，在吸水紙上扣干；加入檢測抗體(2 μg/mL)100 μL /孔，37 ℃孵育2 h；同上用洗液洗滌8次；加入親和素(2 μg/mL)100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；同上用洗液洗滌8次；迅速加入AEC顯色液100 μL/孔，避光顯色15～45 min；待斑點(diǎn)生長到適合的大小之后，以去離子水洗滌2遍，終止顯色過程；將板倒扣在吸水紙上拍干，之后取下保護(hù)層，放在通風(fēng)的地方，室溫靜置10～30 min，將膜自然晾干。PVDF膜上顯示的點(diǎn)代表分泌IFN-γ的特異性淋巴細(xì)胞。樣品的實(shí)驗(yàn)結(jié)果=[(巨型艾美耳球蟲抗原刺激值1-培養(yǎng)基陰性對照值1) + (巨型艾美耳球蟲抗原刺激值2-培養(yǎng)基陰性對照值2)] / 2。

1.2.4 分別收集35～39、47～51和57～61日齡這3個時間段的糞便，檢測每克糞便中卵囊數(shù)(Oocysts per gram，OPG)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析:各組樣品的實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，圖表由GraphPad Prism 5軟件繪制。

2 結(jié)果

2.1 巨型艾美耳球蟲感染激發(fā)宿主產(chǎn)生的體液免疫反應(yīng)和粘膜免疫反應(yīng)

如圖1-A所示，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組雞只隨感染次數(shù)的增加，其抗體水平逐漸升高。膽汁和腸道sIgA的動態(tài)變化與血清IgY的類似(圖1-B和圖1-C)，表明巨型艾美耳球蟲3次間隔感染可以激發(fā)宿主產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答和局部粘膜免疫應(yīng)答。

圖1 巨型艾美耳球蟲激發(fā)宿主產(chǎn)生的抗體應(yīng)答Fig. 1 The specific humoral immune responses of infected chickens在首次感染后5 d(35日齡)和11 d(41日齡)，二次和三次感染后5 d(47和57日齡)，分別采集各組雞只外周血、膽汁和空腸組織，用ELISA分別檢測血清中IgY(A)，膽汁(B)和腸道(C)中sIgA的水平。圖中所示為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，P>0.05表示差異不顯著；P<0.05，以“*”表示差異顯著。Sera, bile and intestinal content samples were collected at day 35, 41, 47 and 57 for the detection of IgY in sera (A), sIgA in bile (B) and intestinal content (C), respectively. Soluble antigen prepared from oocysts were used for the detection of E. maxima-specific antibodies. All values were showed by means ± SE. * indicates the significant difference (P<0.05).

2.2 巨型艾美耳球蟲特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)

如圖2所示，實(shí)驗(yàn)組雞只隨免疫程序的進(jìn)行，其分泌IFN-γ的脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，首次與二次感染相比差異極顯著，二次與三次感染水平相當(dāng)，各期實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，均差異極顯著。可見巨型艾美耳球蟲3 次間隔感染可以激發(fā)宿主產(chǎn)生較高水平的細(xì)胞免疫反應(yīng)。

2.3 巨型艾美耳球蟲感染后雞只卵囊排出量

感染雞只在35～39、47～51和57～61日齡段的糞便OPG平均值分別為7 500、1 500和33，而無球蟲對照組均無卵囊排出(圖3)；第4次感染(82日齡)后無卵囊排出(結(jié)果未顯示)?？梢娋扌桶蓝蛳x3次間隔感染可誘導(dǎo)雞只產(chǎn)生針對同源感染(劑量為5×104卵囊)的完全保護(hù)作用。

3 討論

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(Enzyme-linked immunosorbent spot, ELISPOT)技術(shù)是一種能夠從單細(xì)胞水平檢測特異性抗體分泌細(xì)胞和特異性細(xì)胞因子分泌細(xì)胞的免疫技術(shù)，具有較高的穩(wěn)定性、敏感性和特異性 (Yinetal., 2013)。由于ELISPOT不僅能夠精準(zhǔn)檢測細(xì)胞因子的分泌水平，而且能有效地克服實(shí)時定量PCR及ELISA檢測技術(shù)的不足(Tanguayetal., 1994; Kalyuzhny, 2005)，因此我們利用ELISPOT方法檢測脾臟中針對巨型艾美耳球蟲感染能夠分泌IFN-γ的脾臟淋巴細(xì)胞，以此來反映針對巨型艾美耳球蟲特異性和功能性的淋巴細(xì)胞的數(shù)量。

研究表明，IFN-γ能夠增強(qiáng)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活性，使其產(chǎn)生活性氧中間體，導(dǎo)致宿主細(xì)胞內(nèi)的色氨酸降解，非特異性的清除胞內(nèi)寄生蟲，同時促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放IL-1β、TNF-α、NO等趨化因子，進(jìn)而趨化大量的炎性細(xì)胞聚集到球蟲入侵位點(diǎn)，消除球蟲感染 (Pfefferkornetal., 1984; Lowenthaletal., 1997)。我們通過ELISPOT發(fā)現(xiàn)，隨感染次數(shù)的增加，分泌IFN-γ的脾臟T淋巴細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，說明巨型艾美耳球蟲感染能夠使機(jī)體產(chǎn)生更多的效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞。

圖2 巨型艾美耳球蟲感染雞只產(chǎn)生分泌IFN-γ的T細(xì)胞檢測Fig. 2 The detection of IFN-γ releasing T lymphocytes derived from E. maxima-infected chickensA. 各檢測時間點(diǎn)代表雞只的分泌IFN-γ的T細(xì)胞?！?”為陽性對照(PHA刺激)、“-”為陰性對照(未刺激)、“E.m”代表抗原刺激組(巨型艾美耳球蟲抗原刺激)；B. 各期數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示，不同的大寫字母代表差異極顯著(P<0.01)。A. Representative results for each group. + means PHA as the stimulator, - stands for the negative control, while E.m indicates the E. maxima antigen as stimulator. B. Statistic results from the ELISPOT assay. The number of IFN-γ releasing T lymphocytes was showed as value ± SE. The different capitals stand for significant difference (P<0.01).

圖3 雞只3次感染后的糞便卵囊數(shù)量Fig. 3 Fecal oocyst counting for chickens with 3 infections三次感染的劑量依次為5×102、5×103和5×104 個/只。圖中所示為克糞便卵囊數(shù)量，以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，不同字母之間代表差異極顯著(P<0.01)。The doses for the first, second and third infection were 5×102, 5×103 and 5×104 per bird, respectively. The value of oocyst per gram (OPG) was expressed as Mean ± SE. Different capitals shown on top of each bar stand for the significant difference (P<0.01).

研究認(rèn)為CD4+T細(xì)胞是球蟲首次感染機(jī)體時發(fā)揮重要作用的效應(yīng)細(xì)胞，而CD8+T細(xì)胞是二次感染或多次感染的效應(yīng)細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞能給CD8+T細(xì)胞提供重要的輔助性調(diào)節(jié)作用，CD8+T細(xì)胞能夠殺死被感染的靶細(xì)胞，從而發(fā)揮有效的細(xì)胞免疫保護(hù)(Lillehoj, 1998; Yunetal., 2000)。Rothwell等(1995)人研究發(fā)現(xiàn)，巨型艾美耳球蟲首免后5 與11 d，在雞只小腸的上皮內(nèi)層的CD8+T細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)高峰，而僅在二免后1 h，雞只的上皮內(nèi)層就出現(xiàn)新的CD8+T細(xì)胞高峰，而巨型艾美耳球蟲首免后3～5 d與11 d，在雞只小腸的固有層出現(xiàn)CD4+T細(xì)胞高峰，而在二免后3 和48 h，雞只的固有層出現(xiàn)新的CD8+T細(xì)胞高峰(Rothwelletal., 1995)。本研究發(fā)現(xiàn)，在第3次感染后5天，各組雞只的腸道T細(xì)胞亞群分布也發(fā)生變化，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組CD3+T細(xì)胞比例增加，CD4+和CD8+T細(xì)胞比例不變，但實(shí)質(zhì)上CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù)量上有所增加(數(shù)據(jù)未顯示)，與上述研究結(jié)論相似。

上述研究結(jié)果表明，巨型艾美耳球蟲的強(qiáng)免疫原性能夠激發(fā)宿主產(chǎn)生較高水平的CD4+和CD8+T細(xì)胞，進(jìn)而激發(fā)宿主產(chǎn)生高水平的細(xì)胞免疫應(yīng)答。