李 超 汪運(yùn)舟 陶鴿如 王 丹 焦雅清 顧小龍 索 勛 劉賢勇

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

兔球蟲病是家兔感染一種或數(shù)種艾美耳屬兔球蟲后引起的一類寄生性原蟲病，感染率高，幼兔感染率高達(dá)90%以上(崔平等，2010)，危害大，尤其對(duì)斷奶至3月齡仔兔影響嚴(yán)重，主要引起腹瀉、消瘦、生長(zhǎng)緩慢等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡，每年給養(yǎng)兔業(yè)帶來重大損失(Sherkovetal., 1986)。

目前世界公認(rèn)的兔球蟲有11個(gè)種，主要致病蟲種為：腸艾美耳球蟲Eimeriaintestinalis、黃艾美耳球蟲E.flavescens、大型艾美耳球蟲E.magna和斯氏艾美耳球蟲E.stiedai(Pakandl, 2009)。我國(guó)的兩次兔球蟲病流行病學(xué)調(diào)查指出，家兔的腸艾美耳球蟲平均感染率分別為21.25%(張龍現(xiàn)等, 1999)和14.8% (Jingetal., 2012)，屬于較高水平。已有研究表明，腸艾美耳球蟲屬于高致病性蟲種， 5×103個(gè)卵囊感染即可使仔兔發(fā)病，導(dǎo)致半數(shù)死亡(Coudertetal., 1993)；有報(bào)道，人工感染家兔1×105個(gè)以上卵囊可導(dǎo)致其出現(xiàn)嚴(yán)重臨床癥狀(殷佩云等，1990)；而Shi等(2014)的研究則表明，接種5×103浙江株卵囊未見明顯的臨床癥狀，且免疫原性也弱于之前的報(bào)道。

鑒于這種地方分離株在生物學(xué)特性上的差異，我們對(duì)腸艾美耳球蟲張家口分離株的致病性和免疫原性進(jìn)行了研究，可為今后的兔球蟲病疫苗的開發(fā)提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 卵囊

我們從張家口一兔場(chǎng)利用單卵囊分離技術(shù)，獲得了純種腸艾美耳球蟲，收集9～12 d的卵囊并使其孢子化(在搖床上，卵囊懸于2.5%重鉻酸鉀溶液中，轉(zhuǎn)速為100 r/min，與空氣充分接觸，26 ℃，60 h)。在顯微鏡下觀察其形態(tài)，包括形狀、有無卵膜孔、有無內(nèi)外殘?bào)w，并測(cè)量大小(n=100)。將1 000個(gè)該株孢子化卵囊口服接種無球蟲兔，獲得大量卵囊，用于致病性和免疫原性實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

35～45日齡無球蟲新西蘭大白兔(雌雄各半，體重800～1 000 g)，均來自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)涿州實(shí)驗(yàn)基地?zé)o球蟲兔繁育場(chǎng)。實(shí)驗(yàn)兔均飼養(yǎng)于清潔、通風(fēng)、照明充足的無球蟲兔舍，并且在實(shí)驗(yàn)前經(jīng)糞便檢查確保無球蟲感染。實(shí)驗(yàn)兔均單籠飼養(yǎng)，可自由采食飲水。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

20只無球蟲兔隨機(jī)分為5組，每組4只。第1組為空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)全程不接種球蟲，并飼喂添加抗球蟲藥物的飼料(莫能菌素20 mg/kg和地克珠利1 mg/kg；第2、3、4組為攻蟲組，每只分別口服接種腸艾美耳球蟲孢子化卵囊1×104、1×105、1×106個(gè)；第5組為攻毒對(duì)照組，不接種球蟲。接種后， 0、7、14和21 d稱重；7 d開始，每天觀察家兔臨床癥狀，7 d清糞，10、14和21 d采集糞樣，并稱量糞便總重，以進(jìn)行卵囊檢測(cè)。21 d后，第2、3、4、5組分別接種1×106個(gè)腸艾美耳球蟲進(jìn)行攻毒，并持續(xù)觀察21 d，每天記錄臨床癥狀，攻毒后0、7、14和21 d進(jìn)行體重稱量和糞便采集。每次采集糞樣后，用麥克馬氏法進(jìn)行卵囊計(jì)數(shù)(索勛等，1998)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析。

2 結(jié)果

2.1 腸艾美耳球蟲張家口分離株的鑒定

在40倍顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，卵囊均呈梨形，尖端有明顯的卵膜孔，卵囊內(nèi)有4個(gè)孢子囊和1個(gè)外殘?bào)w，每個(gè)孢子囊內(nèi)有2個(gè)子孢子和1個(gè)內(nèi)殘?bào)w，每個(gè)子孢子內(nèi)有1個(gè)折光體；卵囊長(zhǎng)寬大小均在(27.0～32.0)μm×(17.0～20.0)μm范圍內(nèi)(n=100)，與文獻(xiàn)描述吻合(Eckertetal.，1995)，表明所分離的是純種腸艾美耳球蟲，命名為腸艾美耳球蟲張家口分離株(圖1)。

圖1 腸艾美耳球蟲張家口分離株孢子化卵囊 (標(biāo)尺長(zhǎng)度為20 μm)Fig. 1 Sporulated oocysts of Eimeria intestinalis, ZJK isolate (bar=20 μm)

2.2 腸艾美耳球蟲張家口分離株致病性測(cè)定

2.2.1 臨床癥狀：第2、3、4組實(shí)驗(yàn)兔接種后第8 d開始，均出現(xiàn)不同程度的精神沉郁、厭食等癥狀；9 d后第3、4組所有實(shí)驗(yàn)兔和第2組兩只實(shí)驗(yàn)兔出現(xiàn)腹瀉；14 d后，第3組死亡1只，第4組死亡2只。死后剖檢均發(fā)現(xiàn)腸壁增厚，腸道有明顯出血，確定為球蟲感染所致。接種后14～21 d，耐受個(gè)體臨床癥狀逐漸消失，食欲、精神狀況逐漸恢復(fù)。

2.2.2 體重變化：實(shí)驗(yàn)期間，空白對(duì)照組平均日增重始終保持穩(wěn)定，達(dá)到31～39 g；接種后7 d即腸艾美耳球蟲潛隱期內(nèi)，除第4組體重略有降低外，其余各組體重增長(zhǎng)水平與空白對(duì)照組無差異；接種后7～14 d，第2、3、4組平均日增重均有大幅下降，且第3、4組更為明顯；接種后14～21 d，第4組體重下降幅度明顯降低；第3組體重開始增長(zhǎng)，而第2組則表現(xiàn)體重的迅速代償，日增重超過空白對(duì)照組(表1)。由此可見，腸艾美耳球蟲張家口分離株能夠使家兔致

表 1 初次接種后平均日增重的變化Tab. 1 Mean daily weight gain after first inoculation

使用one-way ANOVA法進(jìn)行多組間差異性分析，平均值(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)上標(biāo)字母表示差異性顯著(P<0.05,n=4)； dpi：接種后天數(shù)。下同。

One-way ANOVA test for significant difference test，means (M±S.D.)with different superscript are significant different；dpi: days post inoculation. The same below.

?。航臃N1×104個(gè)卵囊即可導(dǎo)致明顯的體重下降，影響生產(chǎn)性能；超過1×105個(gè)卵囊的感染可能導(dǎo)致家兔死亡。

2.2.3 卵囊排出量：初次接種后8 d開始，第2、3、4組家兔均排出大量卵囊，接種后11～14 d達(dá)到高峰，18 d之后逐減少。隨著接種劑量的增加，卵囊排出量也增加。其中第4組家兔卵囊排出總量最大，高峰時(shí)期(接種后11～14 d)，平均每只兔可排出卵囊5×108以上(表2)。

表2 初次接種后各組兔平均排卵囊量Tab. 2 Oocyst output per rabbit after first inoculation

2.3 腸艾美耳球蟲張家口分離株免疫原性測(cè)定

為驗(yàn)證腸艾美耳球蟲張家口分離株的免疫原性，我們對(duì)第2、3、4組實(shí)驗(yàn)兔再次接種1×106個(gè)卵囊，第5組作為攻毒對(duì)照組，同樣接種1×106個(gè)卵囊。監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)兔臨床病變、日增重變化、卵囊排出量。

2.3.1 臨床癥狀：攻毒后，免疫組(第2、3、4組)均未出現(xiàn)臨床癥狀；而攻毒對(duì)照組(第5組)則在第7 d開始出現(xiàn)精神沉郁、腹瀉、厭食等癥狀，且生長(zhǎng)嚴(yán)重停滯，18 d后逐漸恢復(fù)?？瞻讓?duì)照組(第1組)生長(zhǎng)良好。

2.3.2 體重變化：攻毒后，免疫組實(shí)驗(yàn)兔日增重均未受到影響，表明機(jī)體已建立了有效的免疫保護(hù)(表3)。其中，第3、4組與空白對(duì)照組(第1組)相比無顯著差異，而第2組日增重水平則高于第1組，出現(xiàn)了一定程度的生長(zhǎng)代償。攻毒對(duì)照組的體重則出現(xiàn)了明顯降低。

2.3.3 卵囊排出量：攻毒后，免疫組的卵囊排出量均為1×106左右，較攻毒對(duì)照組顯著減少，減少率均在99%以上；同時(shí)也遠(yuǎn)低于第一次接種后卵囊排出量，攻毒對(duì)照組家兔則排出超過1×108個(gè)卵囊(表4)。

3 討論

本文對(duì)腸艾美耳球蟲張家口分離株的致病性及免疫原性進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明，感染1×104個(gè)腸艾美耳球蟲孢子化卵囊可引起明顯臨床癥狀，體增重受到抑制，更高劑量的感染則會(huì)導(dǎo)致家兔死亡；同時(shí)腸艾美耳球蟲具有良好的免疫原性，初次感染可激發(fā)良好的保護(hù)性免疫應(yīng)答，從而抵抗再次感染。

表3 攻毒后各組兔平均日增重的變化Tab. 3 Mean daily weight gain after challenge

臨床癥狀、體重變化以及死亡率是衡量兔球蟲致病性的主要標(biāo)準(zhǔn)。之前的研究表明腸艾美耳球蟲致病力較強(qiáng)，半數(shù)致死量為5×103個(gè)卵囊(Coudertetal., 1993)；有研究也表明腸艾美耳球蟲感染后能夠引發(fā)嚴(yán)重的臨床癥狀，家兔生產(chǎn)性能受到極大抑制(Shietal., 2014)。

表4 攻毒后后各組兔平均排卵囊量Tab. 4 Oocyst output per rabbit after challenge

本研究中，張家口分離株致病性稍弱，1×105才能引起個(gè)別家兔死亡，但是引起的臨床病變和體重降低同樣十分明顯，表明了該分離株對(duì)生產(chǎn)有著一定的危害，致病性為中等。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，1×104個(gè)卵囊感染后第3周，實(shí)驗(yàn)兔日增重水平可快速恢復(fù)，表明非致死劑量感染后，家兔能夠較為明顯的代償，這就提示將來活卵囊疫苗應(yīng)用可能會(huì)得到相同的效果，為今后的疫苗研究提供了保證。

腸艾美耳球蟲具有優(yōu)秀的免疫原性，6個(gè)卵囊的免疫就足以減輕攻毒后的臨床表現(xiàn)，而6×102或更多的卵囊，則可提供完全保護(hù)(Coudertetal., 1993)；腸艾美耳球蟲浙江株的初次感染能夠?yàn)閯?dòng)物提供足夠的免疫保護(hù)(Shietal., 2014)。本實(shí)驗(yàn)中，攻毒后免疫組均未表現(xiàn)出臨床癥狀，卵囊排出減少90%以上，表明該株與前人報(bào)道相似，同樣具有良好的免疫原性，再次證明了腸艾美耳球蟲進(jìn)行免疫手段預(yù)防的可行性。

活卵囊疫苗是球蟲病疫苗開發(fā)的趨勢(shì)，但免疫的同時(shí)可能會(huì)對(duì)家兔的健康和生產(chǎn)性能造成影響，因此利用弱毒蟲株是解決該問題的最佳手段。目前國(guó)外已經(jīng)成功地選育出腸艾美耳球蟲早熟株，能夠在保留良好免疫原性的同時(shí)降低其毒力(Licoisetal., 1990)。而國(guó)內(nèi)尚無兔球蟲早熟選育成功的報(bào)道，疫苗研究相對(duì)落后。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了腸艾美耳球蟲張家口分離株具有較強(qiáng)的致病性良好的免疫原性，因此有進(jìn)行早熟選育的必要，以使其成為未來兔球蟲病疫苗的的組分之一。