湯新明 秦 梅 索靜霞 田秀玲 劉賢勇 索 勛

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

和緩艾美耳球蟲Eimeriamitis是7種雞球蟲中常見的一種，致病力較弱，容易被忽視，但其繁殖力較強(qiáng)，大劑量感染后可引起腸道嚴(yán)重炎性反應(yīng)，損傷腸上皮細(xì)胞，誘發(fā)和加劇其他病原如沙門氏菌等的繼發(fā)感染 (索勛等, 1998; Williams, 2001)。因此，了解和緩艾美耳球蟲激發(fā)宿主免疫應(yīng)答的特點(diǎn)和規(guī)律對(duì)于防控和緩艾美耳球蟲病及降低由該病引發(fā)的其他損失如病原的繼發(fā)感染，提高飼料轉(zhuǎn)化率等至關(guān)重要。

雞球蟲免疫研究以柔嫩艾美耳球蟲E.tenella與巨型艾美耳球蟲E.maxima居多。柔嫩艾美耳球蟲和巨型艾美耳球蟲免疫原性強(qiáng)，能激發(fā)宿主較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答 (Huangetal., 2011; Renetal., 2014)。目前認(rèn)為，細(xì)胞免疫應(yīng)答是機(jī)體抵抗球蟲再次感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答的作用機(jī)制，抗體在抗球蟲感染中的作用存在爭(zhēng)議 (Pierceetal., 1965; Roseetal., 1971; Lillehojetal., 2000)。雞球蟲不同種間的免疫原性差別很大，巨型艾美耳球蟲免疫原性最強(qiáng)，口服接種1個(gè)或幾個(gè)卵囊就可以產(chǎn)生對(duì)同種球蟲再次感染的保護(hù)力，但是，巨型艾美耳球蟲對(duì)不同株間的交叉免疫保護(hù)又非常弱，這也是巨型艾美耳球蟲免疫的特點(diǎn)之一 (Swinkelsetal., 2009)；柔嫩艾美耳球蟲不同蟲株間的免疫保護(hù)效果良好 (Chapmanetal., 2013)。上述研究結(jié)果表明，不同種球蟲間的免疫有其共性，每個(gè)種又有著其自身的特點(diǎn)和規(guī)律。因此，研究和緩艾美耳球蟲激發(fā)宿主免疫應(yīng)答的特點(diǎn)和規(guī)律，為防控該病提供理論依據(jù)，需以和緩艾美耳球蟲為研究對(duì)象。

關(guān)于和緩艾美耳球蟲免疫原性及免疫應(yīng)答規(guī)律的認(rèn)識(shí)差異很大，有人認(rèn)為和緩艾美耳球蟲免疫原性極弱，只有經(jīng)過多次免疫才能建立對(duì)和緩艾美耳球蟲再次感染的免疫力 (Tyzzer, 1929; Fitz-Coy, 1980)；有人認(rèn)為和緩艾美耳球蟲免疫原性良好，雞群免疫1次或2次就能建立堅(jiān)強(qiáng)的免疫力 (趙愛云等, 2006)。同樣是和緩艾美耳球蟲，免疫原性出現(xiàn)如此差異，可能與研究時(shí)選用不同蟲株有關(guān)，本研究以實(shí)驗(yàn)室分離的和緩艾美耳球蟲涿州株為研究對(duì)象，研究其免疫原性及激發(fā)宿主免疫應(yīng)答的特征，初步揭示宿主抵抗和緩艾美耳球蟲感染的機(jī)制，為后續(xù)球蟲免疫學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與蟲株

1.1.1 蟲株：和緩艾美耳球蟲涿州株，由本實(shí)驗(yàn)室分離和保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：1日齡AA肉雞購自北京華都肉雞有限公司，飼養(yǎng)于無球蟲污染的禽用隔離器(IPQ-3型，蘇州市蘇杭實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備廠)中，自由采食、飲水。

1.1.3 主要試劑：Chicken IgG(IgY)-Fc Fragment antibody (Bethyl Laboratories, Inc)，TMB (A+B)(邁晨科技)，人淋巴細(xì)胞分離管、Lympho-SpotTM無血清培養(yǎng)基、鏈霉親和素-辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體、AEC顯色液(深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)，96孔ELISPOT板(Millipore)，生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體(1 μg/mL，CHICKEN IFN GAMMA CYTOSET，Invitrogen)等。

1.2 免疫實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

免疫程序見實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(圖1)。簡(jiǎn)言之，12只7日齡AA肉雞隨機(jī)分為2組，免疫組以1 000卵囊/羽劑量(200 μL)進(jìn)行口服免疫，對(duì)照組口服免疫200 μL PBS；第2次免疫于初免后14 d進(jìn)行，免疫劑量為10 000卵囊/羽。

圖1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Fig.1 The experimental schedule

1.3 卵囊排出量統(tǒng)計(jì)

糞便中卵囊含量檢測(cè)依據(jù)參考文獻(xiàn)(Yanetal., 2009)。初免和二免后5～8 d糞便，充分混勻后稱重，利用麥克馬斯特法計(jì)算克糞便卵囊數(shù)(OPG)后計(jì)算卵囊排出量。每份樣品重復(fù)3次。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

ELISA相關(guān)操作依據(jù)參考文獻(xiàn) (Huangetal., 2011)。球蟲全蟲抗原5 μg/mL 4℃過夜包被；5%脫脂乳37℃封閉1 h；雞群一免和二免14 d后血清1∶100稀釋作為一抗，37℃孵育1 h；Chicken IgG(IgY)-Fc Fragment antibody 1∶10 000稀釋作為二抗，37℃孵育1 h(上述各操作均需PBST洗滌5次)；TMB (A+B) 顯色10 min，2 mol/L H2SO4終止顯色后置于酶標(biāo)儀(BIO-RAD)中，450 nm波長(zhǎng)讀取OD值。

1.5 外周血單核淋巴細(xì)胞(PBMC)的分離

雞外周血單核淋巴細(xì)胞的分離依據(jù)人淋巴細(xì)胞分離管的操作說明。無菌靜脈采集二免后2周雞外周抗凝血5 mL，加入分離管，20℃，800 g，離心15 min，吸取淋巴細(xì)胞層(血漿層下，白色薄層)，加入10 mL 1640培養(yǎng)基洗滌一次，Lympho-SpotTM無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。取50 μL細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色，活細(xì)胞計(jì)數(shù)后用于ELISPOT檢測(cè)。

1.6 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT)

ELISPOT相關(guān)操作依據(jù)參考文獻(xiàn) (Yinetal., 2013)。96孔ELISPOT板(Millipore)甲醇預(yù)濕后， 5 μg/mL雞IFN-γ包被抗體4℃過夜包被；1% BSA室溫封閉2 h；每孔加106PBMC后，分別加入10 μL PBS置于37℃、10 μL球蟲全蟲抗原(5 μg/mL)、10 μl PMA+離子霉素(2.5 ng/mL + 1.25 μg/mL)，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱刺激24 h(期間切勿移動(dòng)培養(yǎng)板)；迅速倒掉孔內(nèi)細(xì)胞，加200 μL冷水裂解細(xì)胞10 min；加入100 μL生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，37℃孵育2 h；加入100 μL鏈霉親和素-辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體(2 μg/mL，ALL-IN-ONE mouse ELISPOT Accessory kit)，37℃孵育1 h(上述各操作均需PBST洗滌8次)；加入100 μL AEC顯色液(ALL-IN-ONE mouse ELISPOT Accessory kit)進(jìn)行顯色，室溫避光孵育30 min；去離子水洗滌2次，室溫風(fēng)干，用ELISPOT讀數(shù)儀(Bioreader 4000; Bio-sys, Germany)進(jìn)行讀數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究所有數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行處理，差異顯著性分析采用IBM SPSS Statistics 20軟件中單因素ANOVA分析，P<0.05認(rèn)為差異顯著，P<0.01認(rèn)為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 和緩艾美耳球蟲免疫原性的研究

本研究檢測(cè)了初免及二免后雞群的卵囊產(chǎn)量以評(píng)估和緩艾美耳球蟲的免疫原性。結(jié)果顯示，1 000卵囊/羽免疫后每只雞的卵囊產(chǎn)量約1×107，14 d后免疫劑量提高10倍(即10 000卵囊/羽)，但每只雞的卵囊排出僅為5×105(圖2)。與初次免疫相比，再次免疫后的卵囊排出量顯著降低。

圖2 一次免疫和二次免疫后的卵囊排出量Fig.2 The oocysts output of each bird post primary and boost immunization 5-8 days.p.p.i : 一次免疫；p.b.i: 二次免疫；** P<0.01。p.p.i : Post primary immunization; p.b.i: Post boost immunization. ** P<0.01. The same below.

2.2 和緩艾美耳球蟲激發(fā)宿主體液免疫應(yīng)答的特征

球蟲感染一般能激發(fā)宿主較高水平的抗體反應(yīng)，即使抗體在抗球蟲感染中的作用存在爭(zhēng)議，檢測(cè)球蟲激發(fā)宿主特異性抗體的水平仍能部分反應(yīng)體液免疫應(yīng)答在抗球蟲感染中的作用強(qiáng)度。本研究檢測(cè)了初免和二免后14 d血清中球蟲特異性IgY抗體的水平，發(fā)現(xiàn)一次免疫幾乎不能激發(fā)宿主特異性抗體的產(chǎn)生(OD值<0.5)；二次免疫后，雖然免疫組OD值顯著高于對(duì)照組，但血清抗體水平的絕對(duì)值(OD值約為1.1)仍保持較低水平(圖3)。

圖3 一次免疫(p.p.i)和二次免疫(p.b.i)后雞群血清中特異性IgY抗體的水平Fig. 3 Serum IgY titer post both primary and boost immunization with E. mitis

2.3 和緩艾美耳球蟲激發(fā)宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答的特征

IFN-γ的分泌是T細(xì)胞活化的標(biāo)志之一，特異性抗原刺激下T細(xì)胞活化的數(shù)目是反映針對(duì)該抗原細(xì)胞免疫應(yīng)答強(qiáng)度的重要指征 (Yinetal., 2013)。本研究利用ELISPOT技術(shù)檢測(cè)雞群免疫后外周血淋巴細(xì)胞在球蟲特異性抗原刺激下，分泌IFN-γ淋巴細(xì)胞的數(shù)量，反映球蟲激發(fā)宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答的強(qiáng)度。結(jié)果顯示，免疫后雞群外周血分泌IFN-γ特異性淋巴細(xì)胞的數(shù)量約為80，而未免疫組的6只雞中，只有2只檢測(cè)到數(shù)量極少的斑點(diǎn)(分別檢測(cè)到3個(gè)斑點(diǎn)、9個(gè)斑點(diǎn))(圖4)，說明和緩艾美耳球蟲免疫后，外周血中特異性淋巴細(xì)胞大量增殖，反映出和緩艾美耳球蟲能夠激發(fā)宿主較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。

3 討論

本研究中，免疫雞群后卵囊排出量顯示了和緩艾美耳球蟲涿州株具備良好的免疫原性，且和緩艾美耳能激發(fā)宿主產(chǎn)生較低水平的血清抗體及較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，初步揭示和緩艾美耳球蟲具備良好免疫原性的基礎(chǔ)是由于其激發(fā)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。

圖4 二次免疫后外周血淋巴細(xì)胞中特異性分泌IFN-γ淋巴細(xì)胞的數(shù)量Fig. 4 IFN-γ secretion cell population in PBMCs post the 2nd immunization with E. mitis 14 days第2次免疫后14 d，分離雞外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，PBS、和緩艾美耳球蟲全蟲抗原、PMA+離子霉素刺激24小時(shí)后(A、B、C)檢測(cè)IFN-γ的分泌水平(左側(cè)為免疫組，右側(cè)為對(duì)照組)。各試驗(yàn)組隨機(jī)選取6只雞進(jìn)行IFN-γ分泌水平的檢測(cè)，D圖示各組IFN-γ分泌水平的平均值。IFN-γsecretion cell population in PBMCs post the second immunization with E. mitis 14 days was detected by ELISPOT. The IFN-γsecretion was detected followed by stimulated with PBS, E. mitis antigen and PMA (A, B and C, respectively) about 24 h. D. The average spots of each group was obtained from 6 birds.

和緩艾美耳球蟲激發(fā)宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答的水平個(gè)體間存在差異的可能原因有兩方面，一是本研究中使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是AA肉雞，屬遠(yuǎn)交系群體，個(gè)體差異較大，對(duì)病原感染的反應(yīng)性差異也較大(Zhouetal., 2010)；二是IFN-γ的分泌水平只能部分反應(yīng)細(xì)胞免疫應(yīng)答的強(qiáng)度，即從免疫應(yīng)答的量來反應(yīng)細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，而免疫應(yīng)答的質(zhì)(如多功能T細(xì)胞的數(shù)量)往往是保護(hù)性免疫應(yīng)答的決定因素，這可能出現(xiàn)IFN-γ分泌較少但I(xiàn)FN-γ+TNF-α+IL2+T細(xì)胞的比例、T細(xì)胞的增殖能力和對(duì)免疫應(yīng)答的調(diào)控能力(通過分泌趨化因子)、CTL細(xì)胞的殺傷能力以及中和抗體的親和力等較高的群體免疫保護(hù)力反而較高(Sederetal., 2008)。因此，深入研究球蟲激發(fā)宿主保護(hù)性免疫應(yīng)答的全貌應(yīng)綜合分析其激發(fā)宿主免疫應(yīng)答的量和質(zhì)(Sederetal., 2008)。

和緩艾美耳球蟲具備良好的免疫原性，能激發(fā)宿主較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，但其激發(fā)宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答的強(qiáng)度低于柔嫩艾美耳球蟲。同等劑量、相同的免疫程序，柔嫩艾美耳球蟲二免后每106外周血單核細(xì)胞中分泌IFN-γ特異性淋巴細(xì)胞的數(shù)量為120左右(Yinetal., 2013)，而和緩艾美耳球蟲為80左右(圖4-D)?？赡艿慕忉屖?，柔嫩艾美耳球蟲寄生于盲腸，感染時(shí)能大量招募盲腸扁桃體內(nèi)的淋巴細(xì)胞，球蟲抗原能迅速被識(shí)別和遞呈至機(jī)體免疫系統(tǒng)，繼而激發(fā)宿主較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答(Chapmanetal., 2013)，而和緩艾美耳球蟲裂殖生殖主要在小腸后段進(jìn)行，第3代裂殖生殖和配子生殖亦在盲腸部位進(jìn)行，小腸后段淋巴組織分布相對(duì)較少(McDonaldetal., 1984; Novillaetal., 1987)盲腸扁桃體識(shí)別對(duì)和緩艾美耳球蟲進(jìn)行抗原識(shí)別與遞呈局限于裂殖生殖后期與配子生殖，故激發(fā)的免疫應(yīng)答相對(duì)較弱。

本研究初步揭示了和緩艾美耳球蟲激發(fā)宿主適應(yīng)性免疫應(yīng)答的特征，為解釋其具備良好免疫原性及研究宿主抗和緩艾美耳球蟲感染的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。同樣，和緩艾美耳球蟲作為球蟲病疫苗的組分之一，尚需深入研究其激發(fā)宿主免疫應(yīng)答的全貌，進(jìn)一步揭示球蟲病疫苗提供堅(jiān)強(qiáng)保護(hù)免疫應(yīng)答的機(jī)理。