劉賢勇 索 勛

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

艾美耳球蟲是頂復(fù)門(Phylum Apicomplexa)原蟲中的一大類，其屬于艾美耳科(Eimeriidae)、艾美耳屬Eimeria。艾美耳球蟲廣泛寄生于兩棲動物至哺乳動物。目前已經(jīng)報道的艾美耳球蟲超過1 800種, 而據(jù)推測，這一數(shù)字僅占寄生于所有哺乳動物的艾美耳球蟲種的1.4% (Duszynskietal., 2011)。艾美耳球蟲感染而致的球蟲病給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來了極為嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，全球每年因球蟲病(包括防治費用)給養(yǎng)禽業(yè)造成的損失即超過30億美元(Blakeetal., 2014)。

長期以來，球蟲病的防治以藥物為主。然而隨著球蟲抗藥性的產(chǎn)生及藥物殘留對公眾健康的危害逐漸被認(rèn)識，許多抗球蟲藥已經(jīng)或正在退出市場。由于多種原因，上世紀(jì)90年代以來幾乎沒有抗球蟲新藥上市(Abbasetal., 2011)。球蟲病活卵囊疫苗投入應(yīng)用半個多世紀(jì)以來，在雞球蟲病預(yù)防中發(fā)揮了重要的作用(Williams, 2002)。遺憾的是，市場上還沒有針對其他畜禽的球蟲病疫苗。因此，畜禽球蟲病防治目前面臨著缺乏安全有效的藥物和疫苗的困境。開發(fā)新型抗球蟲藥物及疫苗需要尋找艾美耳球蟲細(xì)胞內(nèi)的特異性藥物靶點或是抗原分子。大量研究表明，頂復(fù)門原蟲的頂質(zhì)體(Apicoplast)為其特有，是抗原蟲藥物開發(fā)的重要靶點(Fleigeetal., 2010)。由此看來，艾美耳球蟲在細(xì)胞發(fā)育、代謝途徑等與宿主存在的顯著差異將為抗球蟲藥物開發(fā)提供新思路。另一方面，在畜禽抗球蟲免疫應(yīng)答機制逐步被揭示的同時，艾美耳球蟲的免疫原性研究也取得一定進(jìn)展，為新型抗球蟲疫苗的研制提供了理論依據(jù)(Sharmanetal., 2010)。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)因其可實現(xiàn)特定靶基因的過表達(dá)、敲除、插入及突變，逐漸成為生命科學(xué)領(lǐng)域最重要的理論和技術(shù)研究手段之一。在頂復(fù)門原蟲中，剛地弓形蟲Toxoplasmagondii、惡性瘧原蟲Plasmodiumfalciparum轉(zhuǎn)基因研究獲得成功(Goonewardeneetal., 1993; Soldatietal., 1993)，為其他近緣物種、包括艾美耳屬球蟲的轉(zhuǎn)基因操作奠定了良好基礎(chǔ)。本文將就艾美耳球蟲轉(zhuǎn)基因研究工作進(jìn)行回顧和展望。

1 艾美耳球蟲轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展

1998年，英國的Tomley研究小組利用微線體1基因的調(diào)控序列作為啟動子成功實現(xiàn)了β-半乳糖苷酶表達(dá)載體在柔嫩艾美耳球蟲E.tenella子孢子中的瞬時轉(zhuǎn)染(Kelleheretal., 1998)，開啟了艾美耳球蟲轉(zhuǎn)基因研究的序幕。我們研究團隊利用黃色熒光蛋白及紅色熒光蛋白作為報告基因，實現(xiàn)了艾美耳球蟲瞬時轉(zhuǎn)染的活細(xì)胞實時檢測(Haoetal., 2007)，為艾美耳球蟲轉(zhuǎn)染研究提供了更為簡便的操作程序。隨后我們及Tomley的研究團隊先后在提高瞬時轉(zhuǎn)染效率、實現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、利用抗藥基因進(jìn)行藥物篩選等方面獲得成功(Clarketal., 2008; Liuetal., 2008; Yanetal., 2009)。最近我們還利用單孢子囊分離技術(shù)建立了轉(zhuǎn)基因球蟲系EtM2e (Liuetal., 2013)上述研究工作是利用艾美耳球蟲的代表性蟲種柔嫩艾美耳球蟲完成的，其盲腸寄生的特征使得經(jīng)泄殖腔接種的被轉(zhuǎn)染子孢子可通過回盲口進(jìn)入盲腸而完成其內(nèi)生性發(fā)育，簡化了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染及體內(nèi)篩選過程。同樣的接種策略也使得和緩艾美耳球蟲E.mitis的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染獲得成功(秦梅等, 待發(fā)表數(shù)據(jù))。通過將轉(zhuǎn)染后的子孢子經(jīng)口接種至胃酸被中和的大鼠，尼氏艾美耳球蟲E.nieschulzi的轉(zhuǎn)染也而獲得了成功(Kurthetal., 2009),且轉(zhuǎn)基因的尼氏艾美耳球蟲在大鼠胚胎原代細(xì)胞中發(fā)育至配子體和卵囊(Hanigetal., 2012; Chenetal., 2013)。斯氏艾美耳球蟲E.stiedai、腸艾美耳球蟲E.intestinalis的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染則是通過外科手術(shù)將轉(zhuǎn)染后的子孢子直接接種于十二指腸而獲得成功(劉賢勇等, 待發(fā)表數(shù)據(jù))。

表1 已進(jìn)行過轉(zhuǎn)染研究的艾美耳球蟲種類Tab. 1 Eimeria spp. have been used for transfection

2 艾美耳球蟲的轉(zhuǎn)基因研究技術(shù)

根據(jù)目前構(gòu)建轉(zhuǎn)基因球蟲獲得成功的研究結(jié)果及我們研究小組的實驗室操作經(jīng)驗，艾美耳球蟲轉(zhuǎn)基因研究的流程大致為：構(gòu)建含有艾美耳球蟲基因調(diào)控序列的報告基因載體，轉(zhuǎn)染純化后的子孢子，接種于細(xì)胞培養(yǎng)觀察瞬時轉(zhuǎn)染成功與否；或者接種至體內(nèi)(如回盲口)并連續(xù)傳代篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染群體，進(jìn)而鑒定基因插入位點和表型，最終通過單孢子囊分離技術(shù)獲得遺傳性能一致的轉(zhuǎn)基因球蟲系(圖1)。

圖1 轉(zhuǎn)基因艾美耳球蟲的構(gòu)建流程Fig. 1 The flowchart for the construction of transgenic eimerian parasites載體構(gòu)建可用yfp基因作為報告基因，同時可以加入源自剛地弓形蟲的藥物篩選基因dhfr-ts，而在雙表達(dá)框載體中，另外一個表達(dá)框可表達(dá)感興趣的外源基因，如禽流感病毒的ha1基因。體外轉(zhuǎn)染可以采用電穿孔儀或核轉(zhuǎn)染儀。篩選與傳代培養(yǎng)則是利用流式細(xì)胞分選技術(shù)和/或藥物篩選壓力，連續(xù)傳代后代卵囊至獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染群體，最后利用單孢子囊分離技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因艾美耳球蟲系。轉(zhuǎn)基因球蟲鑒定通常采用免疫熒光或免疫印跡來鑒定外源蛋白的表達(dá)，同時用染色體步移或質(zhì)粒拯救和DNA測序來確定轉(zhuǎn)基因在球蟲染色體上的整合位點。For the construction of expression vectors, yfp is used as reporter gene in the expression cassette, within which the in-frame fused dhfr-ts2m3m gene is used for drug selection; while interested foreign gene, such as ha1 derived from avian influenza virus, can be inserted into another expression cassette. For the in vitro transfection, Electroporation apparatus (for example, Gene Pulser XcellTM from Bio-Rad or NucleofectorTM from Lonza) can be used for the delivering of plasmid DNA into sporozoites. Selecting and passaging transfectants is carried out by virtue of flow cytometer sorting and/or pyrimethamine selecting. Via single-sporocyst isolation, transgenic lines of eimerian parasites can be obtained from stable transfected population after the successive passaging of the progeny oocysts. The verification of transgenic parasites can be performed with indirect immunofluorescent assay (IFA) or Western blot for the identification of foreign protein expression and genome walking and plasmid rescue for the determination of integration sites of the foreign gene.

現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，當(dāng)報告基因5′及3′的調(diào)控序列都源自艾美耳球蟲基因(如組蛋白his4、微線體蛋白mic1、肌動蛋白actin)時，黃色熒光蛋白在轉(zhuǎn)染的艾美耳球蟲中瞬時或穩(wěn)定表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)剛地弓形蟲的調(diào)控序列，如表面抗原蛋白Sag1和微管蛋白tubulin的啟動子序列都可以驅(qū)動報告基因在柔嫩艾美耳球蟲中的表達(dá)(Zouetal., 2009)；而Kurth等(2009)則用柔嫩艾美耳球蟲的mic1啟動子實現(xiàn)了尼氏艾美耳球蟲的瞬時轉(zhuǎn)染，這證實了近緣物種調(diào)控序列的保守性。而這種保守性也體現(xiàn)在分泌型蛋白的信號肽序列，如剛地弓形蟲致密顆粒蛋白GRA8及惡性瘧原蟲RIFIN蛋白的信號肽序列也能將熒光蛋白靶向至艾美耳球蟲形成的帶蟲空泡(Shietal., 2009)。

為了進(jìn)一步實現(xiàn)外源抗原基因的表達(dá)，雙表達(dá)框策略被引入艾美耳球蟲轉(zhuǎn)基因研究中。比如在同一個質(zhì)粒載體中，將黃色熒光蛋白基因置于mic1啟動子和actin的3′調(diào)控序列之間構(gòu)建成一個表達(dá)框，而將紅色熒光蛋白基因置于Actin的5′和3′調(diào)控序列之間構(gòu)建成另一個表達(dá)框(Yinetal., 2011)。將禽流感病毒的抗原基因替換雙框載體中的紅色熒光蛋白后，我們獲得了表達(dá)ha及np抗原的轉(zhuǎn)基因球蟲(殷光文等，待發(fā)表數(shù)據(jù))。而最近我們將源自口蹄疫病毒的自剪切序列P2A引入表達(dá)載體的構(gòu)建中，實現(xiàn)了同一個表達(dá)框中兩個報告基因的非融合表達(dá)(湯新明等，待發(fā)表數(shù)據(jù))，為表達(dá)多基因的轉(zhuǎn)基因球蟲構(gòu)建奠定了良好基礎(chǔ)。

艾美耳球蟲轉(zhuǎn)染效率除了受調(diào)控元件的選擇、載體DNA大小的影響，還受到轉(zhuǎn)染方法、載體DNA是否線性化等因素的影響。電穿孔或核轉(zhuǎn)染是目前實現(xiàn)艾美耳球蟲轉(zhuǎn)染的常用手段，而在哺乳動物細(xì)胞中普遍應(yīng)用的化學(xué)轉(zhuǎn)化或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法在球蟲轉(zhuǎn)基因操作中尚未見成功的報道。利用限制性內(nèi)切酶將載體DNA線性化可顯著提高艾美耳球蟲的瞬時轉(zhuǎn)染效率，是艾美耳球蟲穩(wěn)定轉(zhuǎn)染獲得成功的重要策略(Liuetal., 2008)。

表達(dá)熒光蛋白的艾美耳球蟲卵囊中可以利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分選，然后對陽性蟲體進(jìn)行再次傳代。經(jīng)過5～10代連續(xù)流式分選和傳代，逐步提高了發(fā)光卵囊在后代群體中的比例。如果構(gòu)建的球蟲轉(zhuǎn)染載體中含有二氫葉酸還原酶-胸苷合成酶突變型基因(dhfr-ts2m3m)，則可以在飼料或飲水中加入乙胺嘧啶藥物，飼喂接種轉(zhuǎn)染后子孢子的雞只(感染后至少18 h后再加入篩選藥物)或后續(xù)傳代的雞只，則通過3代篩選即可獲得群體發(fā)光效率為90%的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染群體(Clarketal., 2008)。

盡管基于熒光表達(dá)的篩選聯(lián)合藥物篩選可以促成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染群體的獲得，但這種轉(zhuǎn)基因群體的遺傳性仍然是不一致的，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因的整合位點是隨機的。通過質(zhì)粒拯救(Plasmid rescue)和染色體步移(Genome walking)等技術(shù)可以檢測群體中多個整合位點的存在(Yanetal., 2009; Suetal., 2012)。我們最近發(fā)現(xiàn)，piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)可以用于艾美耳球蟲的轉(zhuǎn)基因研究，被整合至基因組的DNA分子的特異性位點為TTAA，符合其轉(zhuǎn)座特征(Suetal., 2012)。艾美耳球蟲的孢子生殖分別歷經(jīng)1次減數(shù)分裂和1次有絲分裂，這導(dǎo)致艾美耳球蟲單個卵囊可能是雜合的。因此，為得到遺傳一致的轉(zhuǎn)基因艾美耳球蟲系，就需要利用單孢子囊分離甚至是單子孢子分離技術(shù)來實現(xiàn)此目的。我們用單孢子囊分離技術(shù)成功獲得了融合表達(dá)黃色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因柔嫩艾美耳球蟲系EtM2e (Liuetal., 2013)。

3 轉(zhuǎn)基因艾美耳球蟲的應(yīng)用

利用體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，我們觀察了瞬時表達(dá)熒光蛋白的柔嫩艾美耳球蟲的裂殖生殖及配子生殖階段的蟲體，并借此觀察到了蟲體帶蟲空泡向宿主細(xì)胞漿延伸的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)(Shietal., 2008)。我們將剛地弓形蟲的致密顆粒蛋白GRA7與黃色熒光蛋白基因融合后構(gòu)建表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染柔嫩艾美耳球蟲，發(fā)現(xiàn)表達(dá)的熒光蛋白定位于艾美耳球蟲的帶蟲空泡或者是子孢子囊腔，證實了在真球蟲目(Eucoccidiorida)原蟲間致密顆粒蛋白功能的保守性(Yinetal., 2013)。有研究者在轉(zhuǎn)基因尼氏艾美耳球蟲卵囊中觀察到了1～3個孢子囊而非全部4個孢子囊表達(dá)熒光蛋白的現(xiàn)象，證實了孢子生殖階段存在較高的基因重組頻率(Kurthetal., 2009)。研究還表明，轉(zhuǎn)基因尼氏艾美耳球蟲可在體外培養(yǎng)的大鼠原代細(xì)胞形成的隱窩樣組織中完成4代裂殖生殖及配子生殖，并最終形成卵囊(Chenetal., 2013)。我們對轉(zhuǎn)基因球蟲EtM2e的生物學(xué)特征，如潛在期、免疫原性和致病性進(jìn)行了觀察(Liuetal., 2013; 李秋明等, 2013)，發(fā)現(xiàn)EtM2e蟲株的潛在期與原始母株相似，但其卵囊產(chǎn)量更高(接種劑量為1 000)，且其保持了很好的免疫原性。我們也利用EtM2e持續(xù)表達(dá)黃色熒光蛋白的特征研究了艾美耳球蟲子孢子的提前逸出現(xiàn)象(Yanetal., 2014)。

研究轉(zhuǎn)基因艾美耳球蟲的更大興趣在于將其開發(fā)為活疫苗載體(郝力力等, 2006)。我們的研究證實，轉(zhuǎn)基因艾美耳球蟲表達(dá)的黃色熒光蛋白具有很好的免疫原性；而與黃色熒光蛋白表達(dá)定位于胞漿的轉(zhuǎn)基因球蟲相比，黃色熒光蛋白表達(dá)并分泌至帶蟲空泡的轉(zhuǎn)基因球蟲能激發(fā)更好的黏膜IgA應(yīng)答(Huangetal., 2011)。英國的研究小組也成功構(gòu)建了表達(dá)空腸彎曲桿菌CjaA抗原的轉(zhuǎn)基因柔嫩艾美耳球蟲，用其作為疫苗免疫雞只后，產(chǎn)生了顯著針對病原菌攻毒感染的免疫保護力(Clarketal., 2012)。我們近期利用表達(dá)禽流感病毒HA及NP抗原的轉(zhuǎn)基因球蟲進(jìn)行了免疫和病毒攻毒感染試驗，結(jié)果顯示表達(dá)ha1的轉(zhuǎn)基因柔嫩艾美耳球蟲免疫雞后可以激發(fā)宿主的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，而且可以為同居感染的免疫雞提供一定程度的保護；而表達(dá)NP抗原的轉(zhuǎn)基因柔嫩艾美耳球蟲免疫雞后可以激發(fā)宿主的細(xì)胞免疫應(yīng)答，但不能清除流感病毒的感染(殷光文等，待發(fā)表數(shù)據(jù))。我們申請的基于轉(zhuǎn)基因球蟲的“球蟲新用途”專利已獲得美國專利授權(quán)(Suoetal., 2012)，為這種新型載體疫苗的開發(fā)和推廣提供了良好的知識產(chǎn)權(quán)保護。

4 結(jié)語與展望

盡管當(dāng)前艾美耳球蟲的轉(zhuǎn)基因研究已經(jīng)取得了較好的研究成果，但在轉(zhuǎn)基因操作技術(shù)和轉(zhuǎn)基因球蟲的應(yīng)用方面仍面臨諸多挑戰(zhàn)(Chapmanetal., 2013)。直接轉(zhuǎn)染卵囊就是目前最值得期待的技術(shù)突破。卵囊轉(zhuǎn)染可以省去子孢子提取及外科手術(shù)途徑接種等步驟，簡便易行。盡管我們及其他研究團隊做了大量努力，我們的研究目前還只證實了外源DNA可以被導(dǎo)入巨型艾美耳球蟲E.maxima，未觀察到轉(zhuǎn)基因的表達(dá)(Lietal., 2012)。最近關(guān)于曼氏血吸蟲S.mansoni蟲卵及微小隱孢子蟲卵囊轉(zhuǎn)基因成功的報道為我們進(jìn)行艾美耳球蟲卵囊轉(zhuǎn)染提供新的思路(Rinaldietal., 2012; Lietal., 2014)。

如何提高轉(zhuǎn)染效率和提高轉(zhuǎn)基因的表達(dá)效率也是當(dāng)前艾美耳球蟲轉(zhuǎn)基因的挑戰(zhàn)。利用轉(zhuǎn)座子元件，如piggyBac轉(zhuǎn)座子(Suetal., 2012)，有可能進(jìn)一步提高艾美耳球蟲的轉(zhuǎn)染效率，從而提高轉(zhuǎn)基因成功的可能性。位點特異性重組策略，如基于類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(TALEN)、基于CRISPR/Cas9的基因編輯技術(shù)極有希望成為推動艾美耳球蟲轉(zhuǎn)基因研究的新手段 (Cermaketal., 2011; Barrango, 2014)。在提高轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率方面，需要驗證艾美耳球蟲自身表達(dá)量高的基因、如表面抗原蛋白SAG13的調(diào)控序列是否能提高其調(diào)控的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯水平(湯新明等，未發(fā)表數(shù)據(jù))。

艾美耳球蟲轉(zhuǎn)基因研究取得的重要成就為其防治藥物及疫苗的研發(fā)描繪了光明的前景，假以時日，基于轉(zhuǎn)基因球蟲的活載體疫苗將不僅能實現(xiàn)球蟲病的有效防控，還有望成為預(yù)防畜禽其他重大疫病的多價疫苗。