溫欣，張大為，郭順星，王春蘭

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螃蟹甲內(nèi)生真菌sp.的化學(xué)成分研究

溫欣，張大為，郭順星，王春蘭

100193 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所分析中心

研究一株來源于藏藥螃蟹甲內(nèi)生真菌 PHY-24 的化學(xué)成分。

采用麥麩培養(yǎng)基，對內(nèi)生真菌 PHY-24 進(jìn)行放大培養(yǎng)，通過硅膠柱色譜、MCI 柱色譜、ODS 柱色譜、Sephadex LH-20 柱色譜、高效液相色譜等對其發(fā)酵液中的化學(xué)成分進(jìn)行分離純化，利用 NMR、MS 等波譜方法進(jìn)行化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)鑒定，并測定這些成分抗 HIV-1 整合酶鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)活性。

從內(nèi)生真菌 PHY-24 發(fā)酵液的乙酸乙酯提取部分分離并鑒定了 4 個(gè)化合物，分別是：integrastatin B（1）、2-乙酰基-3,5-二羥基-苯乙酸（2）、curvulin（3）、O-methylcurvulinic acid（4）。其中化合物（1）和（2）具有抗 HIV-1 整合酶鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)活性，其 IC50分別為 6.22 和 75.1 μmol/L。

4 個(gè)化合物均為從此屬真菌中首次分得，其中化合物（1）、（2）具有抗 HIV-1 整合酶鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)活性。化合物（2）的活性為首次報(bào)道。

內(nèi)生真菌； 化學(xué)成分； 螃蟹甲

內(nèi)生真菌是指那些在其生活史中某一段時(shí)期生活在植物組織內(nèi)，對植物組織沒有引起明顯病害癥狀的真菌，包括在其生活史中的某一階段營表生的腐生真菌和對宿主暫時(shí)沒有傷害的潛伏性病原真菌和菌根菌[1]。盡管內(nèi)生真菌廣泛存在于自然界中，但很長時(shí)間內(nèi)沒有被重視。直到 1993 年，美國科學(xué)家 Stierle 等[2]從紅豆杉的內(nèi)生真菌中分離得到了具有抗癌活性的紫杉醇，內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的重要性才逐漸被發(fā)掘。因存在于宿主植物內(nèi)，內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生與宿主植物相同或相近的代謝產(chǎn)物，有時(shí)也能產(chǎn)生新的天然產(chǎn)物，成為天然產(chǎn)物的又一大資源庫[2-3]，而且內(nèi)生真菌具有易培養(yǎng)、培養(yǎng)條件可控、產(chǎn)量較高的特點(diǎn)。國內(nèi)外已有大量文獻(xiàn)報(bào)道了從植物內(nèi)生真菌中分離得到多種活性化合物[4]。本科室從螃蟹甲中分離并鑒定了內(nèi)生真菌 PHY-24（sp.），并測定其發(fā)酵產(chǎn)物具有良好的抗 HIV-1 整合酶鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)活性[5]?；谏鲜霰尘?，本研究對其發(fā)酵產(chǎn)物化學(xué)成分進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 螃蟹甲內(nèi)生真菌sp. 菌株由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所生物中心分離保藏，由本科室張大為鑒定。

1.1.2 儀器 Varian unity 600 型核磁共振儀為美國 Varian 公司產(chǎn)品；AGZAB 2F 型質(zhì)譜儀為英國 VG 公司產(chǎn)品；Waters 600 高效液相色譜儀、XBridge C18 分析型色譜柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm）、XBridge C18 制備色譜柱（18 mm × 150 mm，4 μm）為美國 Waters 公司產(chǎn)品；Phenomenex Synergi Hydro-RP C18 分析型色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）、Phenemonex Hydro 制備色譜柱（21.20 mm × 250 mm，4 μm）為美國 Phenomenex公司產(chǎn)品；Pump Manager C-615 中壓色譜柱為瑞士 Buchi 公司產(chǎn)品。

1.1.3 試劑 分析純石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、丙酮購自北京化工廠；色譜純甲醇購自美國Burdick & Jackson 公司；薄層色譜硅膠板 GF254、柱色譜硅膠 H、300 ~ 400 目硅膠、200 ~ 300 目硅膠均購自青島海洋化工廠；Sephadex LH-20 購自美國Pharmacia 公司；核磁試劑（CDCl3、CD3OD、氘代試劑作為內(nèi)標(biāo)）購自美國Sigma 公司。

1.2 方法

1.2.1 放大發(fā)酵 按照每升麥麩培養(yǎng)基含 30 g 麥麩、20 g葡萄糖、1.5 g MgSO4·7H2O、3 g KH2PO4的配方制備培養(yǎng)基。從平板 PDA 培養(yǎng)基上挑取 PHY-24 菌塊接種到裝有 150 ml 麥麩培養(yǎng)基的 250 ml 三角瓶中，采用搖床振蕩培養(yǎng) 2 ~ 3 d，搖床轉(zhuǎn)速控制在 120 r/min，培養(yǎng)溫度設(shè)定為 25 ℃。將培養(yǎng)好的 PHY-24 菌種液每瓶轉(zhuǎn)接至裝有 2.5 L 麥麩培養(yǎng)基的 5 L 三角瓶中，采用搖床振蕩培養(yǎng) 17 ~ 18 d，搖床轉(zhuǎn)速控制在 120 r/min，培養(yǎng)溫度設(shè)定為 25 ℃。每一批次的 PHY-24 放大發(fā)酵物為 10 L，共得發(fā)酵物 30 L。

1.2.2 提取分離 用尼龍布分離 PHY-24 發(fā)酵液和菌絲體。發(fā)酵液加入 1 倍體積乙酸乙酯，萃取濃縮得乙酸乙酯提取物 20 g。取10 g提取物采用硅膠柱色譜純化，以石油醚:乙酸乙酯（5:1），二氯甲烷:甲醇（10:1），甲醇進(jìn)行梯度洗脫，共得14 流分。Fr8（0.8 g）經(jīng) Sephadex LH-20（甲醇）及制備HPLC（90% 甲醇-水，流速 8 ml/min）得化合物 1（31 mg）。另取 10 g 提取物采用 MCI 柱色譜純化，以甲醇-水不同比例梯度洗脫，共得 9 流分。Fr3（0.21 g）析出晶體，經(jīng)重結(jié)晶得化合物 2（27 mg）。Fr4（0.35 g）經(jīng) HPLC 制備（55% 甲醇-水，流速 10 ml/min）得化合物 3（22 mg）和化合物 4（34 mg）。

1.2.3 抗 HIV-1 整合酶鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)活性測定 參照 He 等[6]建立的 HIV-1 整合酶鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)活性檢測方法。反應(yīng)在 96 孔透明微孔板中進(jìn)行。用1 × 反應(yīng)緩沖液（25 mmol/L 哌嗪-1,4-二乙磺酸、10 mmol/L β-巰基乙醇、0.1 g/L BSA、5% 無菌甘油、20 mmol/L MnCl2）100 μl 洗板一次。加入 5 μl 用 DMSO 配制的待測樣品（陽性對照組為 50 mmol/L 的黃芩素，陰性對照組為溶劑 DMSO）至微孔板中，與整合酶在 2 × 反應(yīng)緩沖液中 37 ℃溫育 20 min。加入 1.5 pmol/L 供體 DNA 和 15 pmol/L 靶 DNA 底物，混勻后 37 ℃反應(yīng) 2 h。加入 1.5 μl 鏈霉親和素磁珠和 51.5 μl 結(jié)合緩沖液[10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.6，2 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，0.1%（w/v）吐溫 20]徹底振蕩混勻，20 ℃孵育15 min，每隔 5 分鐘振蕩混勻一次。將微孔板置于板式磁珠收集器靜置 90 s，棄上清液。用 100 μl TBST（含 0.1% Tween 20 的Tris-HCl 緩沖鹽溶液）洗磁珠 3 次。加入100 μl 用 TBST 按照 1:5000 稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的地高辛抗體，振蕩混勻后于 37 ℃孵育 30 min。100 μl TBST 洗磁珠 3 次，將磁珠轉(zhuǎn)移到新的微孔板中。加入 100 μl 顯色底物緩沖液（6.7 mmol/L 對硝基苯磷酸二鈉、0.1 mol/L Na2CO3、2 mmol/L MgCl2，pH 9.5），避光顯色30 min。用酶標(biāo)儀測定 405 nm 處的吸光值（405）。用以下公式計(jì)算藥物對腫瘤細(xì)胞的抑制率，并通過非線性擬合計(jì)算 IC50。

抑制率 =A陰性對照－A樣品× 100% A陰性對照－A陽性對照

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物 1：棕色粉末（TCM），ESI-MS m/z:403 [M+H]+。1H-NMR（CDCl3，600MHz）δ：1.94（3H，s，H-19），2.20（3H，s，H-18），3.81（3H，s，H-21），3.82（3H，s，H-22），7.11（1H，s，H-7），7.21（1H，s，H-13），10.29（1H，s，H-20）。13C-NMR （CDCl3，600 MHz）δ：25.58（C-19），26.07（C-18），56.26（C-21），56.48（C-22），77.40（C-10），97.04（C-2），101.57（C-7），105.41（C-13），120.00（C-8），120.01（C-3），120.99（C-11），125.62（C-12），139.31（C-4），139.34（C-16），139.87（C-15），140.59（C-5），146.97（C-14），147.51（C-6），190.41（C-20），193.18（C-9）。與文獻(xiàn)[7]數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定為integrastatin B（圖 1A）。

化合物 2：白色粉末（MeOH），ESI-MS m/z:211 [M+H]+。1H-NMR（MeOH，600MHz）δ：6.27（1H，d，J = 2.4，H-8），6.21（1H，d，J = 2.4，H-6），3.65（2H，s，H-2），2.52（3H，s，H-2'）。13C-NMR（MeOH，600MHz）δ：206.15（C-1'），175.27（C-1），161.91（C-7），161.03（C-5），137.94（C-3），120.58（C-4），l12.03（C-8），102.71（C-6），40.79（C-2），32.38（C-2'）。與文獻(xiàn)[8-9]數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定為curvulin acid，即 2-乙?；?3,5-二羥基苯乙酸（圖 1B）。

圖 1 化合物 1（A）和 2（B）結(jié)構(gòu)式

Figure 1 The molecular structures of compound 1 (A) and 2 (B)

化合物 3：無色片狀結(jié)晶（MeOH），ESI-MS m/z:239[M+H]+。參考文獻(xiàn)[9]鑒定為curvulin。

化合物 4：白色粉末（MeOH 或 DMSO），ESI-MS m/z:225[M+H]+。與文獻(xiàn)[9]數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定為 O-methylcurvulinic acid。

2.2 HIV-1 整合酶鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)抑制劑篩選

采用高通量 ELISA 方法測定了化合物的抗 HIV-1 整合酶鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)活性。結(jié)果表明，化合物 1、2 具有抗 HIV-1 整合酶鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)活性，IC50分別為 6.22 和 75.1 μmol/L。其余 2 個(gè)化合物均無此活性。

3 討論

從藏藥螃蟹甲內(nèi)生真菌 PHY-24 發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯提取物中分離得到 4 個(gè)化合物，均為sp. 中首次分得。這 4 個(gè)化合物文獻(xiàn)報(bào)道僅從微生物中得到[7-12]。到目前為止，integrastatin B 報(bào)道具有抗 HIV-1 整合酶活性，其 IC50為 2.5 μmol/L[7]；curvulin acid 未見任何活性報(bào)道；curvulin、O-methylcurvulinic acid 僅被報(bào)道為植物毒素，可致馬齒莧和多刺莧菜黑斑病[10]。

對上述化合物進(jìn)行抗 HIV-1 整合酶鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)活性篩選，結(jié)果顯示化合物 1 具有明顯的抗 HIV-1 整合酶鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)活性，其 IC50為6.22 μmol/L，與文獻(xiàn)[7]報(bào)道基本一致；化合物 2 的抗 HIV-1 整合酶鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)活性較微弱，其 IC50為 75.1 μmol/L，為本文首次報(bào)道。

目前，針對 PHY-24菌株活性代謝產(chǎn)物的研究仍在繼續(xù)，以期發(fā)現(xiàn)其他的活性成分。

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Chemical constituents of an endophytic fungussp. fromMukerjee

WEN Xin, ZHANG Da-wei, GUO Shun-xing, WANG Chun-lan

To study the chemical constituents of an endophytic fungus PHY-24 (sp.) from Tibetan medicinal plantsMukerjee.

PHY-24 culture was scaled-up using wheat bran medium. The chemical constituents from the fermentation broth of the strain PHY-24 were isolated and purified by silica gel, MCI, ODS and Sephadex LH-20 column chromatography, and their chemical structures were identified by analysis of MS and NMR. Bioactivities of the constituents were tested with anti-HIV-1 integrase strand transfer reaction.

Four compounds were separated and identified from the fermentation broth, including integrastatin B, curvulin acid, curvulin, O-methylcurvulinic acid. Integrastatin B and curvulin acid have anti-HIV-1 activity with IC50being 6.22 μmol/L and 75.1 μmol/L, respectively.

The four compounds were firstly obtained from thegenus, with integrastatin B and curvulin acid having anti-HIV-1 integrase strand transfer reaction activity. The activity of curvulin acid was firstly reported.

Endophytic fungus; Chemical constituents;Mukerjee

WANG Chun-lan, Email: wangchunlan2006@163.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.06.007

王春蘭，Email：wangchunlan2006@163.com

2014-04-17

Author Affiliation: Analysis Center, Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China