劉虹，王佳平，辛冰牧，邵榮光

?

GSK3β抑制劑SB216763通過激活小鼠成纖維細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白抑制TGF-β1誘導(dǎo)的I型膠原產(chǎn)生

劉虹，王佳平，辛冰牧，邵榮光

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所（劉虹、邵榮光）；100094 北京，中國航天員科研訓(xùn)練中心（王佳平、辛冰牧）

探討 SB216763 對小鼠成纖維 3T3-NIH 細(xì)胞 I 型膠原表達(dá)和分泌的影響。

使用轉(zhuǎn)化生長因子 TGF-β1 誘導(dǎo)膠原的表達(dá)，使用天狼猩紅染色試劑盒及 Western blot 檢測 I 型膠原和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。

給予 TGF-β1 后，細(xì)胞培養(yǎng)上清中膠原含量從（11.85 ± 0.90）mg/ml 上升至（16.70 ± 0.67）mg/ml（< 0.001），說明TGF-β1 可以劑量依賴地促進(jìn)成纖維細(xì)胞中膠原的表達(dá)與分泌；同時，TGF-β1 還可以抑制自噬相關(guān)蛋白 Vsp34、Beclin-1 的表達(dá)，促進(jìn) p62 的堆積；給予 SB216763 后，細(xì)胞培養(yǎng)上清中膠原的含量從（16.83 ± 0.47）mg/ml 下降為（13.16 ± 0.45）mg/ml（< 0.05），說明 SB216763 可以降低 TGF-β1 誘導(dǎo) I 型膠原的表達(dá)；此外，SB216763 還可以恢復(fù)成纖維細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白 Vsp34、Beclin-1 的表達(dá)，降低 p62 的表達(dá)。

小分子抑制劑 SB216763 通過激活自噬活性抑制 TGF-β1 誘導(dǎo)的 I 型膠原表達(dá)。

自噬； 膠原 I 型； 轉(zhuǎn)化生長因子 β1； SB216763

肺纖維化是各種內(nèi)、外致病原引起慢性肺疾病的共同后果，以肺組織炎癥和纖維化為共同病理特征，嚴(yán)重威脅人類健康和生命[1]。肺纖維化可引起肺泡持續(xù)性損傷、細(xì)胞外基質(zhì)反復(fù)破壞、修復(fù)、重建并過度沉積，導(dǎo)致正常肺組織結(jié)構(gòu)改變、功能喪失[2]。此外，多種慢性肺疾病，包括哮喘、慢性支氣管炎、支氣管擴(kuò)張、慢性阻塞性肺病、肺結(jié)核、肺癌、間質(zhì)性肺病等，均伴有纖維化病理改變[3]。細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積是肺纖維化疾病的主要病理改變，其主要來源是成纖維細(xì)胞，主要成分是不可溶性纖維蛋白膠原[4]。轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）通過促進(jìn)膠原的轉(zhuǎn)錄繼而導(dǎo)致膠原表達(dá)增加[5]；同時，在肺纖維化的肺組織中，膠原的降解能力也是被顯著抑制的[3, 6]。因此，恢復(fù)肺組織中膠原的降解能力，有可能成為治療肺纖維化疾病的新思路。

自噬是細(xì)胞的一種自我代謝過程，有利于細(xì)胞在外界刺激下維持自身穩(wěn)態(tài)平衡。近來有報(bào)道指出，在肺纖維化疾病中，自噬是降解膠原的主要方式[3, 6]。Fernandez 和Eickelberg[7]直接指出，在多種肺部疾病中，自噬是組織細(xì)胞維持代謝平衡、促進(jìn)細(xì)胞生存的主要機(jī)制。上述研究報(bào)道均是在動物模型中探討自噬的活性與肺纖維化發(fā)生的關(guān)系，目前仍缺乏在細(xì)胞水平，尤其是在成纖維細(xì)胞中，自噬活化可以促進(jìn)膠原降解的證據(jù)。

糖原合成激酶 3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，可以參與調(diào)控多種細(xì)胞活動，其中包括能量代謝、神經(jīng)細(xì)胞的形成及發(fā)育等。我們的前期工作表明，GSK3β 的小分子抑制劑SB216763 可以通過促進(jìn) Bcl-2 與 GSK3β 的結(jié)合，抑制 Bcl-2 與 Beclin-1 的結(jié)合，激活自噬核心復(fù)合物，從而上調(diào)自噬的活性[8]。然而，SB216763 能否通過活化自噬改善成纖維細(xì)胞中膠原的含量仍需要進(jìn)一步證實(shí)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 3T3-NIH 細(xì)胞購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞培養(yǎng)中心，細(xì)胞使用DMEM培養(yǎng)基，10% FBS 培養(yǎng)，每隔 2 天傳代一次，細(xì)胞培養(yǎng)條件為 37 ℃、5% CO2。

1.1.2 主要試劑 DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基、進(jìn)口血清FBS 和胰酶購于美國 Gibco 公司；天狼猩紅染色試劑盒購于英國 Biocolor 公司；SB216763、雷帕霉素及抗小鼠 p62 購于美國 Sigma-Aldrich 公司；抗小鼠 β-actin、Beclin-1、Vps34 抗體購自美國 Cell Signaling Technology 公司；I 型膠原抗體購于英國 Abcam 公司；RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度定量試劑盒購于碧云天生物科技研究所。

1.2 方法

1.2.1 天狼猩紅染色檢測 I 型膠原 根據(jù)文獻(xiàn)[6]的方法，使用轉(zhuǎn)化生長因子 TGF-β1 以不同的劑量（0、5 和 10 ng/ml）作用于小鼠成纖維細(xì)胞 48 h 后，收集細(xì)胞，4 ℃、600 ×離心 20 min 后取上清，按照膠原檢測試劑盒說明書檢測膠原含量。

1.2.2 Western blot 取適量培養(yǎng)細(xì)胞，加入 RIPA 裂解液后振蕩混勻，冰上放置 30 min，間或振蕩；4 ℃、4560 ×條件下離心 15 min。取上清，使用蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，其具體步驟參照說明書進(jìn)行。調(diào)節(jié)蛋白至相同濃度，分裝，加入 5 倍上樣緩沖液，96 ℃變性 10 min，一部分用于 SDS 電泳，一部分–80 ℃保存[3]；使用 Amersham 顯色系統(tǒng)顯色，經(jīng) Western blot 印跡分析軟件測出各條帶的光密度值并進(jìn)行分析[6]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1 促進(jìn)小鼠成纖維細(xì)胞中膠原的產(chǎn)生

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予TGF-β1 后，細(xì)胞培養(yǎng)上清中膠原含量從（11.85 ± 0.90）mg/ml 上升至（16.70 ± 0.67）mg/ml，說明 TGF-β1 可以劑量依賴地促進(jìn)小鼠成纖維細(xì)胞分泌膠原（圖 1A）；同時，對成纖維細(xì)胞中膠原的表達(dá)量檢測發(fā)現(xiàn)，TGF-β1 可以劑量依賴地增加小鼠成纖維細(xì)胞胞內(nèi) I 型膠原以及 α-SMA 的表達(dá)（圖 1B）。以上結(jié)果說明，TGF-β1 可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞中膠原的產(chǎn)生。

2.2 TGF-β1 抑制小鼠成纖維細(xì)胞中自噬的活化

在單獨(dú)給予雷帕霉素（100 ng/ml）誘導(dǎo)自噬活化時，成纖維細(xì)胞中自噬活化蛋白 Vps34 以及Beclin-1 的表達(dá)增加，自噬活化蛋白 p62 表達(dá)有所降低，說明自噬被活化；而在給予 TGF-β1（5 ng/ml）后，Vps34 以及 Beclin-1 的表達(dá)水平有所降低，p62 表達(dá)升高，說明自噬的活性下降（圖 2）。以上的結(jié)果表明，TGF-β1 可以抑制雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬活化。

圖 1 TGF-β1 誘導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞中膠原的產(chǎn)生（A：天狼猩紅染色；B：Western blot）

Figure 1 Type I collagen was induced by TGF-β1 (A: Sirius red staining; B: Western blot)

圖 2 TGF-β1 抑制小鼠成纖維細(xì)胞中自噬的活化

Figure 2 Autophagy-related proteins were regulated by TGF-β1 in mouse fibroblast cells

圖 3 SB216763 抑制 TGF-β1 誘導(dǎo)的膠原產(chǎn)生（A：天狼猩紅染色；B：Western blot）

Figure 3 Increased type I collagen by TGF-β1 was reduced by SB216763 (A: Sirius red staining; B: Western blot)

2.3 小分子抑制劑 SB216763 抑制 TGF-β1 誘導(dǎo)的膠原產(chǎn)生

給予 TGF-β1（5 ng/ml）以及 SB216763（10 μmol/L）共同作用 48 h 后，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)上清中膠原的含量從（16.83 ± 0.47）mg/ml 下降為（13.16 ± 0.45）mg/ml，說明 SB216763 可以降低 TGF-β1 誘導(dǎo)的膠原分泌（圖 3A）；此外，我們對小鼠成纖維細(xì)胞胞內(nèi) I 型膠原進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，SB216763 可以降低小鼠成纖維細(xì)胞胞內(nèi) I 型膠原的含量（圖 3B）。以上的結(jié)果說明，在小鼠成纖維細(xì)胞中，SB216763 可以抑制 TGF-β1 誘導(dǎo)的膠原產(chǎn)生。

2.4 小分子抑制劑 SB216763 恢復(fù)成纖維細(xì)胞中自噬的活性

在 TGF-β1 誘導(dǎo)膠原表達(dá)的同時給予SB216763 刺激后，檢測自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)，自噬相關(guān)蛋白 Vps34 及 Beclin-1 的表達(dá)水平有所降低，p62 表達(dá)升高，說明自噬的活性下降；而在給予 SB216763 刺激時，成纖維細(xì)胞中 Vps34 及 Beclin-1 的表達(dá)增加，p62 的表達(dá)有所降低，說明自噬被活化（圖 4）。以上的結(jié)果表明，SB216763 可以恢復(fù)自噬活性。

圖 4 SB216763 恢復(fù)小鼠成纖維細(xì)胞中自噬的活化

Figure 4 Autophagy-related proteins were regulated by SB216763 in mouse fibroblast cells

3 討論

組織纖維化是許多慢性疾病致殘和致死的主要原因，組織損傷是纖維化的始動環(huán)節(jié)。當(dāng)疾病的病程較短、組織受損傷較小時，受損組織周邊的正常實(shí)質(zhì)細(xì)胞或少量的間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)性增生，促進(jìn)損傷被修復(fù)，恢復(fù)正常組織結(jié)構(gòu)和功能，不會導(dǎo)致纖維化病理過程；如果組織受損傷嚴(yán)重，大量組織細(xì)胞壞死，會導(dǎo)致器官功能的衰竭，引起壞死后硬化或機(jī)體死亡；如果損傷長時間不愈合，反復(fù)出現(xiàn)細(xì)胞損傷壞死，超出了周圍正常實(shí)質(zhì)/間質(zhì)細(xì)胞的修復(fù)能力，則會造成實(shí)質(zhì)/間質(zhì)細(xì)胞不斷增生以修復(fù)受損的組織，即發(fā)生纖維化病理過程[9]。在上述過程中，受到損傷的組織（細(xì)胞）主要是指 3 種細(xì)胞，即成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞和單核細(xì)胞[9]。其中，成纖維細(xì)胞是膠原沉積過程中膠原的主要來源[3]。因此，我們選擇了在成纖維細(xì)胞中觀察 SB216763 對膠原分泌的影響。

TGF-β1 在肺纖維化的過程中發(fā)揮了重要的作用。一方面，TGF-β1 可以活化核轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)相關(guān)啟動子區(qū)組件，從而啟動膠原和纖連蛋白基因轉(zhuǎn)錄[10]，促進(jìn)膠原的表達(dá)；另一方面，TGF-β1 還通過抑制膠原降解的過程，進(jìn)一步加重膠原的沉積：增加自噬活性可以促進(jìn)膠原的降解，從而改善組織中膠原的沉積[3, 6]；然而，在特發(fā)性肺纖維化患者的肺組織中，自噬活性是被顯著抑制的，TGF-β1 可以通過激活 mTORC1 抑制纖維母細(xì)胞中自噬的活性[11]。上述研究表明，TGF-β1 可以通過增加膠原轉(zhuǎn)錄及抑制膠原通過自噬途徑降解兩方面，共同促進(jìn)膠原的沉積。

目前，已有證據(jù)表明 SB216763 可以調(diào)節(jié)纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展。有研究指出，SB216763 可以改善由博來霉素誘導(dǎo)的小鼠急性肺纖維化，同時降低炎性細(xì)胞因子[12]，但卻不能影響肺纖維化組織中膠原的轉(zhuǎn)錄水平[8]，說明SB216763 是有可能通過促進(jìn)膠原降解降低膠原的表達(dá)。在體外培養(yǎng)的人肺成纖維細(xì)胞中，SB216763 可以抑制 TGF-β1 誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物，抑制成纖維細(xì)胞的活化[13]。然而，也有報(bào)道指出，SB216763 可以通過激活 Wnt/β-caternin 信號通路加重皮膚纖維化[14]。以上的研究表明，SB216763 對纖維化疾病的調(diào)節(jié)作用可能存在組織差異性。

大量文獻(xiàn)表明，自噬活性與膠原的降解密切相關(guān)[3, 6]。Kim 等[15]也指出在腎纖維化中，TGF-β1 可以誘導(dǎo)膠原的產(chǎn)生，而活化自噬可以促進(jìn)胞外膠原的降解。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SB216763 可以通過誘導(dǎo)多種自噬相關(guān)蛋白的產(chǎn)生（例如Beclin-1、Vps34 以及 p62），從而激活自噬的活化。Zhou 等[16]發(fā)現(xiàn)在缺血損傷的大鼠腦組織中，SB216763 可以促進(jìn)LC3-II 的表達(dá)，增加 LC3 點(diǎn)狀聚集，從而改善其腦損傷情況。然而，也有報(bào)道表明，在具有耐藥性的慢性骨髓性白血病細(xì)胞中，SB216763 可以通過增加 Atg5 以及 mTOR 的蛋白表達(dá)水平，從而降低自噬的活性[17]。以上研究表明，SB216763 在纖維化疾病以及腫瘤中對自噬的活性具有不同的調(diào)節(jié)作用，這可能是由于 SB216763 抑制GSK3β 的活性后，導(dǎo)致一種生長因子被剝奪的生理狀態(tài)，而這種狀態(tài)在纖維化疾病以及腫瘤組織中會對自噬產(chǎn)生截然不同的影響。

自噬核心復(fù)合物在自噬的活化過程中發(fā)揮了重要的作用。在靜息狀態(tài)下，Bcl-2 通過BH3 結(jié)構(gòu)域與 Beclin-1 結(jié)合，抑制自噬的活化[18]。盡管 SB216763 可以抑制 Bcl-2 的降解[19]，但是，SB216763 可以通過促進(jìn) Bcl-2 與 GSK3β 的結(jié)合，抑制 Bcl-2 與 Beclin-1 的結(jié)合，激活自噬核心復(fù)合物，從而活化自噬的發(fā)生[8]。我們的結(jié)果顯示，SB216763 還可以通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白 Vps34、Beclin-1 以及 p62 的表達(dá)影響自噬的活化，上述研究補(bǔ)充了 SB216763 調(diào)控自噬活化的分子機(jī)制。

在本文中，我們發(fā)現(xiàn)在小鼠成纖維細(xì)胞中，GSK3β 抑制劑 SB216763 可以通過增加自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，激活自噬的發(fā)生，促進(jìn)膠原的降解，最終改善由 TGF-β1 誘導(dǎo)的膠原分泌。本研究表明，使用小分子化合物 SB216763 適度激活自噬的活性，可以為改善肺纖維化提供新的治療思路與方案。

[1] Wynn TA. Integrating mechanisms of pulmonary fibrosis. J Exp Med, 2011, 208(7):1339-1350.

[2] Noble PW, Barkauskas CE, Jiang D. Pulmonary fibrosis: patterns and perpetrators. J Clin Invest, 2012, 122(8):2756-2762.

[3] Yang HZ, Wang JP, Mi S, et al. TLR4 activity is required in the resolution of pulmonary inflammation and fibrosis after acute and chronic lung injury. Am J Pathol, 2012, 180(1):275-292.

[4] Kravis TC, Ahmed A, Brown T, et al. Pathogenic mechanisms in pulmonary fibrosis: collagen-induced migration inhibition factor production and cytotoxicity mediated by lymphocytes. J Clin Invest, 1976, 58(5):1223-1232.

[5] Gressner AM, Weiskirchen R, Breitkopf K, et al. Roles of TGF-beta in hepatic fibrosis. Front Biosci, 2002, 7:d793-d807.

[6] Mi S, Li Z, Yang HZ, et al. Blocking IL-17A promotes the resolution of pulmonary inflammation and fibrosis via TGF-beta1-dependent and -independent mechanisms. J Immunol, 2011, 187(6):3003-3014.

[7] Fernandez IE, Eickelberg O. New cellular and molecular mechanisms of lung injury and fibrosis in idiopathic pulmonary fibrosis. Lancet, 2012, 380(9842):680-688.

[8] Liu H, Mi S, Li Z, et al. SB216763, a selective small molecule inhibitor of glycogen synthase kinase-3, improves bleomycin-induced pulmonary fibrosis via activating autophagy. Acta Pharm Sinica B, 2013, 3(4):226-233.

[9] Liu H, Xie Q, Li YZ, et al. The overexpression of tribbles homolog 3 promotes the secretion of collagen I in mouse fibroblast cell. Chin Med Biotechnol, 2014, 9(1):37-42. (in Chinese)

劉虹, 謝瓊, 李勇枝, 等. 過表達(dá)Tribbles同源蛋白3促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌I型膠原的研究. 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2014, 9(1):37-42.

[10] Dai C, Liu Y. Hepatocyte growth factor antagonizes the profibrotic action of TGF-beta1 in mesangial cells by stabilizing Smad transcriptional corepressor TGIF. J Am Soc Nephrol, 2004, 15(6): 1402-1412.

[11] Patel AS, Lin L, Geyer A, et al. Autophagy in idiopathic pulmonary fibrosis. PLoS One, 2012, 7(7):e41394.

[12] Gurrieri C, Piazza F, Gnoato M, et al. 3-(2,4-dichlorophenyl)-4-(1- methyl-1H-indol-3-yl)-1H-pyrrole-2,5-dione (SB216763), a glycogen synthase kinase-3 inhibitor, displays therapeutic properties in a mouse model of pulmonary inflammation and fibrosis. J Pharmacol Exp Ther, 2010, 332(3):785-794.

[13] Baarsma HA, Engelbertink LH, van Hees LJ, et al.Glycogen synthase kinase-3 (GSK-3) regulates TGF-β1-induced differentiation of pulmonary fibroblasts. Br J Pharmacol, 2013, 169(3):590-603.

[14] Bergmann C, Akhmetshina A, Dees C, et al. Inhibition of glycogen synthase kinase 3β induces dermal fibrosis by activation of the canonical Wnt pathway. Ann Rheum Dis, 2011, 70(12):2191-2198.

[15] Kim SI, Na HJ, Ding Y, et al. Autophagy promotes intracellular degradation of type I collagen induced by transforming growth factor (TGF)-β1. J Biol Chem, 2012, 287(15):11677-11688.

[16] Zhou X, Zhou J, Li X, et al. GSK-3β inhibitors suppressed neuroinflammation in rat cortex by activating autophagy in ischemic brain injury. Biochem Biophys Res Commun, 2011, 411(2):271-275.

[17] Reddiconto G, Toto C, Palamà I, et al. Targeting of GSK3β promotes imatinib-mediated apoptosis in quiescent CD34+ chronic myeloid leukemia progenitors, preserving normal stem cells. Blood, 2012, 119(10):2335-2345.

[18] Sinha S, Levine B. The autophagy effector Beclin 1: a novel BH3-only protein. Oncogene, 2008, 27 Suppl 1:S137-S148.

[19] Liu H, Mi S, Li Z, et al. Interleukin 17A inhibits autophagy through activation of PIK3CA to interrupt the GSK3B-mediated degradation of BCL2 in lung epithelial cells. Autophagy, 2013, 9(5):730-742.

GSK3β inhibitor SB216763 suppresses the expression and secretion of TGF-β1-induced collagen I through stimulating autophagy-related proteins in mouse fibroblast cells

LIU Hong, WANG Jia-ping, XIN Bing-mu, SHAO Rong-guang

The aim of this study is toinvestigate the effects of SB216763 on the expression and secretion of type I collagen in mouse fibroblast 3T3-NIH cells.

Type I collagen was induced by treatment with TGF-β1, and the expression of type I collagen was detected by Sirius red staining kit and Western blot. Autophagy related proteins were detected by Western blot.

TGF-β1 dose-dependently induced the expression and secretion of type I collagen from (11.85 ± 0.90)mg/ml to (16.70 ± 0.67)mg/ml (< 0.001) in 3T3-NIH cells. Meanwhile, TGF-β1 affected the expressions of autophagy-related proteins, as shown by the decrease of Vsp34 and Beclin-1, and the increase of p62. In contrast, SB216763 markedly reduced the expression and secretion of type I collagen from (16.83 ± 0.47)mg/ml to (13.16 ± 0.45)mg/ml (< 0.05). Moreover, SB216763 restored the levels of Vsp34 and Beclin-1, and down-regulated the expression of p62 in TGF-β1-treated cells.

SB216763 suppresses the expression and secretion of thetype I collagen induced by TGF-β1 through stimulating autophagy-related proteins in mouse fibroblast cells.

Autophagy; Collagen type I; Transforming growth factor beta 1; SB216763

SHAO Rong-guang, Email: shaor@imb.pumc.edu.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.06.001

國家自然科學(xué)基金（31401186）；“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項(xiàng)（2012ZX09301002-001- 015）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)（IMBF201407）

邵榮光，Email：shaor@imb.pumc.edu.cn

2014-04-22

Author Affiliations: Department of Oncology, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China (LIU Hong, SHAO Rong-guang); State Key Laboratory of Space Medicine Fundamentals and Application, China Astronaut Research and Training Centre, Beijing 100094, China (WANG Jia-ping, XIN Bing-mu)