劉旭杰，秦燁，陳淑珍

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吉西他濱對肺微血管內(nèi)皮細胞的損傷及表沒食子兒茶素沒食子酸酯的保護作用

劉旭杰，秦燁，陳淑珍

100050 北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所腫瘤室

觀察吉西他濱對大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞的影響及表沒食子兒茶素沒食子酸酯的保護作用。

利用植塊法分離大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞。SRB 法檢測藥物對肺微血管內(nèi)皮細胞和 A549 增殖的影響。流式細胞儀用于檢測細胞周期和細胞凋亡。Western blot 法檢測凋亡相關(guān)蛋白含量。測定細胞內(nèi)活性氧和超氧化物歧化酶水平以及乳酸脫氫酶滲透情況。

吉西他濱能顯著減少肺微血管內(nèi)皮細胞細胞增殖并將其阻滯于 S 期。吉西他濱引起肺微血管內(nèi)皮細胞細胞凋亡具有時間依賴性，處理 24、48、72 h 后細胞凋亡率分別為 7.2%、15.4%、23.3%。同時，吉西他濱作用后細胞內(nèi)活性氧含量上升，而處理 48 h 后超氧化物歧化酶水平顯著下降。進一步研究發(fā)現(xiàn)，表沒食子兒茶素沒食子酸酯能夠提高吉西他濱處理后肺微血管內(nèi)皮細胞的存活率，并且減弱吉西他濱造成的超氧化物歧化酶水平的下降。

吉西他濱對肺微血管內(nèi)皮細胞具有損傷作用，能夠引起肺微血管內(nèi)皮細胞的凋亡和氧化應(yīng)激的發(fā)生，而表沒食子兒茶素沒食子酸酯對吉西他濱引起的肺微血管內(nèi)皮細胞損傷具有保護作用。

內(nèi)皮細胞； 氧化性應(yīng)激； 兒茶酚類； 吉西他濱

吉西他濱（gemcitabine）是一種脫氧胞苷類似物，在臨床上被廣泛應(yīng)用于胰腺癌、非小細胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌等實體瘤的治療[1]。但隨著臨床應(yīng)用范圍的擴大，其引發(fā)嚴重肺毒性的報道也逐漸增多。臨床研究顯示，超過 23% 的患者由于使用吉西他濱，出現(xiàn)嚴重呼吸困難、彌散性肺泡損傷、間質(zhì)性肺炎等肺部癥狀[2]。嚴重肺損傷限制了化療的延續(xù)性和患者的生活質(zhì)量。因此，研究吉西他濱導致肺損傷的機制并加以改善是提高其臨床效果的一個重要方向。

肺微血管內(nèi)皮細胞（pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs）是肺泡毛細血管單位的基本組成部分，在維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)及引發(fā)炎癥等方面發(fā)揮重要作用。PMVECs 易于受到吸入性或肺循環(huán)中毒劑的影響，引發(fā)動物和人的急性肺損傷[3]。研究顯示，氧化應(yīng)激是藥物誘發(fā)肺毒性的損傷機制之一，其能夠引發(fā)細胞凋亡、炎癥反應(yīng)、血管結(jié)構(gòu)和功能的異常[4]。體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平的上升或氧化防御機制的失調(diào)，均能引發(fā)氧化應(yīng)激。已有報道，多種胰腺癌細胞對吉西他濱的敏感性與細胞內(nèi) ROS 水平正相關(guān)[5]。

本論文通過分離大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞并進行體外培養(yǎng)，分別從細胞凋亡和氧化應(yīng)激兩方面研究吉西他濱對 PMVECs 的影響。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是從綠茶中提取的多酚類物質(zhì)，屬于兒茶素家族，具有抗增殖、抗突變、抗氧化、防癌等多種作用[6]。本文同時探索 EGCG 對吉西他濱引起 PMVECs 損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性Sprague-Dawley 大鼠（SPF 級），購自軍事醫(yī)學科學院動物中心，體重 100~120 g，動物合格證號：SCXK-（軍）2012-0004。

1.1.2 細胞株 人非小細胞肺癌 A549 為本實驗室保存。

1.1.3 試劑和試劑盒 吉西他濱購自中國食品藥品檢定研究院，批號：100622-201202；EGCG 購自江西綠康天然產(chǎn)物有限責任公司，純度為 98%，批號：D98-120602；ROS 熒光探針CM-H2DCFDA 購自美國 Invitrogen 公司；磺基羅丹明B（SRB）、PI 均購自美國 Sigma Aldrich 公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基、RPMI 1640 培養(yǎng)基均購自美國 Hyclone 公司；胎牛血清購自美國 Gibco 公司；小鼠抗大鼠 CD31 抗體購自美國 Abcam 公司；兔抗 caspase-3 抗體、兔抗 PARP 抗體均購自美國 CST 公司；小鼠抗 β-actin 抗體購自天津三箭生物技術(shù)有限公司；羅丹明標記的山羊抗小鼠 IgG 抗體、辣根酶標記山羊抗小鼠/兔 IgG 抗體均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；化學發(fā)光 HRP 底物試劑盒購自美國 Millipore 公司；RIPA 細胞裂解液購自北京 GenStar 公司；Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒購自北京寶賽生物公司；乳酸脫氫酶（LDH）細胞毒性檢測試劑盒、總超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.1.4 儀器 TE2000-U 型熒光顯微鏡為日本 Nikon 公司產(chǎn)品；Multiskan MK 3 酶標儀為美國 Thermo 公司產(chǎn)品；Coulter epics XL 流式細胞儀為美國 Beckman 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 大鼠 PMVECs 的分離、培養(yǎng)和鑒定 選用體重 100~120 g 的健康雄性 SD 大鼠，參考文獻[7-8]，按植塊培養(yǎng)方法進行大鼠 PMVECs 的原代培養(yǎng)。同時應(yīng)用抗 CD31 抗體進行免疫熒光法鑒定，取其中 3 ~ 5 代細胞用于實驗研究。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 人非小細胞肺癌 A549 培養(yǎng)于含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)基中，于 37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.3 SRB 法檢測細胞增殖抑制活性 取對數(shù)生長期的細胞，每孔 100 μl 接種于 96 孔培養(yǎng)板，置于培養(yǎng)箱，經(jīng) 24 h 貼壁后，每孔加入 100 μl 不同濃度的藥液；繼續(xù)培養(yǎng) 48~72 h 后，棄去培養(yǎng)基并加入 100 μl 10% 三氯乙酸溶液，于 4 ℃固定 1 h，用蒸餾水沖洗 5 次后晾干；然后加入 0.4% SRB，染色 5 min，用 1% 乙酸溶液沖洗 5 次后晾干；加入 100 μl Tris 溶液（10 mmol/L）溶解結(jié)合的 SRB；使用酶標儀于 560 nm 波長讀取各孔光吸收值。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI 染色法檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的細胞培養(yǎng)于 25 cm2細胞培養(yǎng)瓶（5 × 105個/瓶）；培養(yǎng) 24 h 后加入不同濃度的藥物進行培養(yǎng)，依據(jù)試劑盒操作步驟進行樣品處理，然后使用流式細胞儀檢測凋亡細胞比例。

1.2.5 細胞周期分析 細胞以 5 × 105個/瓶接種于 25 cm2細胞培養(yǎng)瓶；經(jīng) 24 h 培養(yǎng)貼壁后，加入 1 μmol/L 吉西他濱分別處理 24、48、72 h；利用胰酶消化收集細胞，并用 70% 乙醇溶液于–20 ℃固定過夜；使用 50 μg/ml PI 染色 30 min 后，流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.6 Western blot 檢測 將待檢測細胞置于冰上，并用 RIPA 細胞裂解液處理細胞 30 min，收集細胞裂解液；于 4 ℃使用 12 000 ×離心細胞裂解液 15 min，并收集上清；然后利用 12% 凝膠進行 SDS-PAGE 電泳，并轉(zhuǎn)至 PVDF 膜上；使用 5% 脫脂牛奶溶液封閉膜上非特異抗原位點，再加入相應(yīng)一抗（1:1000 稀釋）4 ℃孵育過夜，并用 TBST 洗 5 次；然后加入對應(yīng)二抗（1:4000 稀釋），再用 TBST 洗 5 次；使用 HRP 底物試劑盒進行顯影。

1.2.7 ROS 含量檢測 以 5 × 103個/孔將 PMVECs 種于 96 孔黑壁透明底培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h 使其貼壁；給予 0.1、1、10 μmol/L 吉西他濱處理 12 h；藥物處理后，使用 PBS 洗 1 次，并加入 10 μmol/L CM-H2DCFDA作用 30 min；使用熒光酶標儀讀取各孔熒光強度。使用以下公式計算各孔熒光強度增值百分比：

熒光增值百分比=[（F1– F0）/F0]× 100%，其中，F(xiàn)1為給藥組熒光強度；F0為對照組熒光強度。

1.2.8 乳酸脫氫酶細胞毒性檢測 根據(jù)乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒操作步驟，檢測 0.1、1、10 μmol/L 吉西他濱處理后，PMVECs 細胞培養(yǎng)液上清中 LDH 含量的變化。

1.2.9 細胞內(nèi) SOD 活性檢測 以0.1、1、10 μmol/L 藥物濃度處理細胞48、72 h，按照總 SOD 活性檢測試劑盒操作步驟，利用 WST 法進行樣品處理，并用酶標儀在 450 nm 波長處檢測值。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 PMVECs 形態(tài)學及免疫熒光鑒定結(jié)果

通過顯微鏡觀察，植塊貼壁后，血細胞首先從組織塊邊緣游出；培養(yǎng) 24 h 后，PMVECs開始由植塊周圍爬出，貼壁生長；繼續(xù)培養(yǎng)至 60 ~ 72 h 間，晃動培養(yǎng)瓶使組織塊脫落并吸棄，避免成纖維細胞爬出。培養(yǎng)至 9 d，細胞基本匯合成片后，進行傳代培養(yǎng)。由于血細胞不貼壁，隨傳代操作被棄去。PMVECs 在顯微鏡下呈現(xiàn)上皮樣細胞形態(tài)，匯集成片后，呈鋪路石樣排列生長（圖 1A、B）。與 PBS 替代一抗的陰性對照組相比，PMVECs 的免疫熒光檢測呈現(xiàn) CD31 抗原陽性表達（圖 1C、D）。

2.2 吉西他濱對 PMVECs 和 A549 的增殖抑制活性

為了評估吉西他濱的血管損傷作用，使用不同濃度（0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10 μmol/L）吉西他濱分別處理 PMVECs 和 A549 細胞 48 和 72 h。然后利用 SRB 法檢測細胞存活率。結(jié)果顯示，吉西他濱對兩種細胞的抑制增殖作用具有濃度依賴性和時間依賴性（圖 2），而且對于兩種細胞來說，吉西他濱的抑制作用均在 0.03 ~ 1 μmol/L 濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)顯著變化。因此，吉西他濱在抑制腫瘤細胞生長的濃度范圍內(nèi)對 PMVECs 亦有損傷作用。

2.3 吉西他濱對 PMVECs 產(chǎn)生 S 期阻滯作用

為了進一步說明吉西他濱抑制細胞增殖的機制，我們檢測了 1 μmol/L 吉西他濱處理 24、48 和 72 h 后，PMVECs 細胞周期的變化。結(jié)果顯示，吉西他濱處理后 S 期細胞所占比例增加，并呈現(xiàn)時間依賴性，藥物處理 24、48 和 72 h 相對應(yīng)的S 期細胞比例為 15.0%、27.4%、35.5%、47.2%；G2/M 期細胞顯著減少（圖 3）。同時，Sub-G1峰比例逐漸增加，說明吉西他濱引起細胞周期阻滯，繼而導致細胞凋亡發(fā)生。

2.4 吉西他濱誘導 PMVECs 凋亡

細胞凋亡也是藥物引起損傷的一個表現(xiàn)，本研究利用 Annexin V/PI 染色法檢測細胞凋亡情況。1 μmol/L 吉西他濱處理細胞后，PMVECs 的凋亡率隨時間延長而增加；與對照組 6.2% 的凋亡率比較，藥物作用 24、48 和 72 h 相對應(yīng)的凋亡率分別為 7.2%、15.4%、23.3%（圖 4A）。吉西他濱引起的細胞凋亡也具有濃度依賴性，藥物濃度為 0.1、1、10 μmol/L 時細胞凋亡率為 6.9%、13.7%、11.6%，而對照組為 6.9%。為了進一步說明吉西他濱處理與 PMVECs 細胞凋亡的關(guān)系，利用Western blot對細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達及活化情況進行了檢測。根據(jù)圖 4C 顯示，吉西他濱作用 48 h 后能夠激活 PMVECs 細胞內(nèi) caspase-3，同時也上調(diào) PARP 剪切體的含量。由此可以判斷，吉西他濱能夠誘導 PMVECs 細胞凋亡。

圖 1 PMVECs 的原代培養(yǎng)（A：組織塊貼壁后 60 h 細胞生長狀態(tài)；B：90 h 后細胞生長狀態(tài)）和使用抗 CD31 抗體進行 PMVECs 免疫熒光鑒定（紅色表示 CD31 位點；藍色表示細胞核；C：鑒定組，一抗和二抗；D：對照組，PBS 和二抗）（× 100）

Figure 1 Primary culture of PMVECs (A: The proliferation of PMVECs in 60 h after explants adhered to flasks; B: The proliferation of PMVECs in 90 h) and PMVECs identified with CD31 antibody by immunofluorescence staining (Red color represents CD31; Blue color indicates nuclei; C: Identification, primary antibody and secondary antibody; D: Control, PBS and secondary antibody) (× 100)

圖 2 吉西他濱對于 PMVECs（A）和 A549（B）的抑制增殖作用（n = 4）

Figure 2 Anti-proliferation effects of gemcitabine in PMVECs (A) and A549 (B) cells (n = 4)

對照組 Control24 h G1/G0：59.4%S：15.0%G2/M：25.6%Sub-G1：5.8%G1/G0：68.1%S：27.4%G2/M：4.5%Sub-G1：6.9% 48 h72 h G1/G0：59.4%S：35.5%G2/M：5.1%Sub-G1：26.9%G1/G0：52.2%S：47.2%G2/M：0.6%Sub-G1：41.6%

Figure 3 Effects of gemcitabine on the regulation of cell cycle distribution in PMVECs

圖 4 吉西他濱引起 PMVECs 細胞凋亡（A：不同作用時間對細胞凋亡的影響；B：不同藥物濃度對細胞凋亡的影響；C：凋亡相關(guān)蛋白表達情況）

Figure 4 Gemcitabine caused apoptosis of PMVECs (A: Cell apoptosis at the different times; B: Cell apoptosis at the different concentrations of gemcitabine; C: The expression of apoptosis-related proteins)

圖 5 吉西他濱處理后 PMVECs 產(chǎn)生氧化應(yīng)激（A：ROS 含量；B：SOD 活性）（**P < 0.01，n = 3）

Figure 5 Gemcitabine induced oxidative stress in PMVECs (A: ROS; B: SOD) (**< 0.01, n = 3)

2.5 吉西他濱處理后 PMVECs 產(chǎn)生氧化應(yīng)激

2.5.1 細胞內(nèi) ROS 含量的檢測 通過檢測細胞內(nèi) ROS 含量，判斷 PMVECs 經(jīng)過吉西他濱處理后是否出現(xiàn)氧化應(yīng)激。由于 CM-H2DCFDA 能夠進入細胞，與細胞內(nèi) ROS 反應(yīng)生成熒光物質(zhì)，所以可以通過產(chǎn)生的熒光強度對細胞內(nèi) ROS 進行定量分析。PMVECs 在不同濃度吉西他濱處理 12 h 后，10 μmol/L 藥物組細胞內(nèi)熒光強度出現(xiàn)明顯提升（**< 0.01），相對對照組增值為（16.0 ± 7.3）%（圖 5A）。

2.5.2 細胞內(nèi) SOD 水平的檢測 除了檢查 ROS 水平，我們進一步檢測了細胞內(nèi)氧化防御機制中關(guān)鍵酶 SOD 的活性。經(jīng)過吉西他濱處理后，細胞內(nèi) SOD 水平顯著下降（**< 0.01）。吉西他濱處理 24、48、72 h 后，細胞內(nèi) SOD 活力分別相當于對照組的（86.2 ± 0.9）%、（65.9 ± 2.0）%、（40.2 ± 2.9）%（圖 5B）。

2.5.3 LDH 細胞毒性檢測 為了檢測細胞氧化應(yīng)激后是否出現(xiàn)膜損傷，進行了 LDH 細胞毒性檢測，通過細胞培養(yǎng)基上清中 LDH 含量反映細胞膜受損情況。圖 6 顯示細胞培養(yǎng)基上清中 LDH 含量隨吉西他濱濃度增加而顯著上升，同時隨著作用時間延長，LDH 含量也有所提高。相對對照組，10 μmol/L 吉西他濱作用 48 和 72 h 對應(yīng)的 LDH 相對增值為（21.1 ± 7.8）%、（28.8 ± 6.5）%，具有顯著性差異（**< 0.01）。

LDH 細胞毒性（%）LDH cytotoxicity (%)4035302520151050 0.1 1 10 吉西他濱濃度（μmol/L）Concentration of gemcitabine (μmol/L)

Figure 6 LDH cytotoxicity assay of PMVECs with gemcitabine (**< 0.01, n = 3)

2.6 EGCG 對吉西他濱損傷 PMVECs 的保護作用

2.6.1 EGCG 增加 PMVECs 存活率 通過 SRB 法檢測多種血管保護藥對吉西他濱損傷PMVECs 的作用，我們發(fā)現(xiàn) EGCG 具有保護作用。如圖 7 顯示，EGCG 單藥或與吉西他濱聯(lián)用時均能顯著提高 PMVECs 的存活（*< 0.05），并具有濃度依賴性。其中 0.1和1 μmol/L 吉西他濱單藥處理后， PMVECs 存活率分別為（96.4 ± 2.4）%、（54.3 ±2.7）%，而 25 μmol/L EGCG 與 0.1、1 μmol/L 吉西他濱聯(lián)用時，存活率分別為（127.9 ± 20.9）% 和（64.4 ± 4.1）%；而 EGCG 對于吉西他濱抑制肺癌 A549 細胞的作用并無明顯影響（圖 7）。

2.6.2 EGCG 提高 PMVECs 細胞內(nèi) SOD 水平 檢測細胞內(nèi)總 SOD 活性的結(jié)果如圖 8 所示，25 μmol/L EGCG 單藥組與陰性對照組相比，PMVECs 內(nèi) SOD 活性增加了（30.2 ± 2.0）%，（**< 0.01）。同時，25 μmol/L EGCG 和 1 μmol/L吉西他濱聯(lián)用組與 1 μmol/L 吉西他濱單藥組比較，SOD 活性提高了（30.1 ± 9.0）%（**< 0.01）。因此，說明 EGCG 能夠提高 PMVECs 細胞內(nèi) SOD 水平，一定程度逆轉(zhuǎn)吉西他濱引起的 SOD 水平下降。

Figure 7 Effects of EGCG and gemcitabine on the survival of PMVECs (A) and A549 (B) cells (*< 0.05)

SOD 相對活性（%）Vitality of SOD (%)140120100806040200 對照組 EGCG GEM GEM + EGCG Control

Figure 8 Effects of EGCG and gemcitabine on the activity of SOD in PMVECs (EGCG: 25 μmol/L; GEM: 1 μmol/L;**< 0.01, n = 3)

3 討論

理想的抗癌藥物應(yīng)能夠在抑制腫瘤細胞的同時不影響正常組織細胞的功能。因此，研究目前抗癌藥物的副作用并加以改善是探索理想藥物的捷徑。在目前的臨床實踐中，吉西他濱是最常見的抗腫瘤藥物之一，被 FDA 批準用于治療多種腫瘤。然而，Belknap 等[9]的研究顯示，1997 – 2003 年，關(guān)于吉西他濱引起肺毒性的報告有 178 篇。而針對吉西他濱引發(fā)的肺損傷，主要通過停止給予吉西他濱并使用甾體類藥物治療，如甲基強的松龍，但仍有一部分患者出現(xiàn)致死癥狀[10-12]。有研究表明，急性肺損傷與藥物引起的肺血管內(nèi)皮細胞損傷有關(guān)[3]。本文通過分離大鼠 PMVECs，研究吉西他濱對大鼠 PMVECs 的體外作用。與吉西他濱對肺癌 A549 細胞的作用相似，其對 PMVECs 具有時間依賴性和濃度依賴性的抑制增殖作用，并具有S 期阻滯作用。因此，吉西他濱發(fā)揮抗癌作用的同時也抑制了 PMVECs 的活性。

吉西他濱作為脫氧胞苷類似物，能夠摻入 DNA 合成并干擾 DNA 復制。有文獻報道，吉西他濱的細胞毒作用主要是摻入 DNA 并啟動細胞凋亡進程，而不是僅終止 DNA 復制[13-14]。我們的結(jié)果顯示，吉西他濱引起的細胞凋亡率主要隨藥物作用時間延長而提高，但當藥物濃度達到一定水平后凋亡率變化無明顯濃度依賴性。同時，細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白 caspase-3 和 PARP 的檢測也說明吉西他濱能夠引起 PMVECs 凋亡。而以上結(jié)果中，吉西他濱引起的細胞凋亡并不是十分明顯。因此，凋亡可能是吉西他濱損傷肺微血管內(nèi)皮細胞的一個途徑，而不是主要的損傷途徑。吉西他濱引起的內(nèi)皮損傷可能是多種機制綜合的結(jié)果，我們同時檢測了氧化應(yīng)激在此過程中發(fā)揮的作用。

細胞內(nèi) ROS 水平的穩(wěn)定是影響細胞氧化還原平衡和細胞增殖的重要因素。雖然細胞具有精密的氧化調(diào)控機制，但是許多抗腫瘤藥物仍能引起細胞的氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激一方面參與對腫瘤細胞的細胞毒作用，如吉西他濱能夠提升 A549 細胞的 ROS 水平[15]；另一方面引起對正常組織的損傷，如吉西他濱的結(jié)構(gòu)類似物阿糖胞苷能夠通過引發(fā)氧化應(yīng)激而促進體外培養(yǎng)的大腦皮層神經(jīng)元細胞凋亡[16]。同時，大量文獻顯示，ROS 的產(chǎn)生能夠誘導內(nèi)皮細胞凋亡，進而引發(fā)血管損傷[17-19]。我們通過檢測吉西他濱對 PMVECs 細胞內(nèi) ROS 和 SOD 的影響發(fā)現(xiàn)，吉西他濱能夠降低細胞內(nèi)氧化防御機制關(guān)鍵酶 SOD 的活性，并提升 ROS 水平。LDH 細胞毒性顯示吉西他濱處理后的 PMVECs 出現(xiàn)細胞膜滲漏的現(xiàn)象。這些結(jié)果說明，吉西他濱能夠通過氧化途徑損傷 PMVECs。

EGCG 具有一定的心血管保護作用，包括調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能紊亂、心肌肥大、高血壓、心肌細胞損傷等作用[20]。本文實驗結(jié)果表明，EGCG 在相對小劑量（25 μmol/L）時與吉西他濱聯(lián)用能夠減弱吉西他濱對 PMVECs 的增殖抑制作用，而在相應(yīng)藥物劑量下并未影響吉西他濱對肺癌 A549 細胞的抑制作用，表現(xiàn)出對正常內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞的不同作用效果。同時，EGCG 也能增加 PMVECs 細胞內(nèi) SOD 的活性，此種作用可能是 EGCG 顯示出對 PMVECs 具有保護作用的原因。然而，EGCG 對 A549 細胞并未顯示出保護作用，推斷 ROS 在吉西他濱對 A549 細胞的細胞毒性中作用微弱，而在 PMVECs 損傷中具有較大影響；具體原因尚需要進一步探索?？傊?，EGCG 對吉西他濱作用于腫瘤細胞和正常血管內(nèi)皮的影響具有差異。

綜上所述，吉西他濱能夠引起肺微血管內(nèi)皮細胞損傷，而這種損傷作用一方面通過增加細胞凋亡產(chǎn)生，另一方面通過引起細胞的氧化應(yīng)激介導。而 EGCG 能夠在不影響吉西他濱對腫瘤細胞的抑制作用下，減弱吉西他濱引起的內(nèi)皮細胞損傷。吉西他濱與 EGCG 的聯(lián)用方式有待于進一步研究，可為減緩吉西他濱所引起的肺毒性提供幫助。

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Damage of gemcitabine towards pulmonary microvascular endothelial cells and protective effects of EGCG

LIU Xu-jie, QIN Ye, CHEN Shu-zhen

To investigate the damage of gemcitabine on rat pulmonary microvascular endothelial cells and the protective effect of EGCG.

PMVECs were isolated by modification of a tissue explant method. SRB assay was used to investigate the growth of PMVECs and A549 cells. Flow cytometry was applied to measure the cell cycle and apoptosis. Western blot was used to determine the content of apoptosis-related proteins. The activities of ROS, SOD and LDH were examined with microplate reader.

The exposure to gemcitabine decreased the survival of PMVECs and arrested PMVECs at S phase. Gemcitabine increased the number of apoptotic cells time-dependently and the percentage of apoptotic cells treated for 24, 48, 72 h were 7.2%, 15.4%, 23.3%, respectively. Meanwhile, intracellular ROS level of PMVECs was elevated and after 48 h the SOD level was lowered markedly after gemcitabine treatment. Further investigation revealed that EGCG increased cell viability of PMVECs with or without gemcitabine and augmented the intracellular SOD level of PMVECs reduced by gemcitabine.

These results suggest that gemcitabine injures PMVECs by inducing pulmonary endothelial cell apoptosis and oxidative stress. EGCG exerts the protective effect on gemcitabine-induced endothelial cells injury.

Endothelial cells; Oxidative stress; Catechols; Gemcitabine

CHEN Shu-zhen, Email: bjcsz@imb.pumc.edu.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.06.005

國家自然科學基金（81072664、81373437）；“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項（2012ZX09301002-001-022-01）

陳淑珍，Email：bjcsz@imb.pumc.edu.cn

2014-03-18

Author Affiliation: Laboratory of Oncology, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China