萬曉珊，劉彥隆，張翼，肖業(yè)臣，張海淼，許竹梅，肖健

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內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對3T3-L1脂肪細(xì)胞成纖維細(xì)胞生長因子21 mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

萬曉珊，劉彥隆，張翼，肖業(yè)臣，張海淼，許竹梅，肖健

325035 溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院（萬曉珊、劉彥隆、張翼、肖業(yè)臣、許竹梅、肖?。?；430075 武漢華大醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司（張海淼）

在 mRNA 水平探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對 3T3-L1 脂肪細(xì)胞成纖維細(xì)胞生長因子 21 表達(dá)的影響。

利用經(jīng)典雞尾酒法誘導(dǎo) 3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化，再用毒胡蘿卜內(nèi)酯分別按照劑量梯度（0、6.25、12.5、25、50 和 100 nmol/L）和時間梯度（0、1、3、6 和 12 h）進(jìn)行處理，實時 PCR 檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白C/EBP 同源蛋白和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78 以及成纖維細(xì)胞生長因子 21 mRNA 的表達(dá)水平。

毒胡蘿卜內(nèi)酯能誘導(dǎo)分化成熟的 3T3-L1 脂肪細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促進(jìn) C/EBP 同源蛋白、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78 和成纖維細(xì)胞生長因子 21 mRNA 水平顯著升高，且與毒胡蘿卜內(nèi)酯的劑量和處理時間呈正相關(guān)。當(dāng)用 100 nmol/L毒胡蘿卜內(nèi)酯處理 6 h 后，成纖維細(xì)胞生長因子 21 mRNA 水平顯著增高，為對照組的 114.55 倍（< 0.05）。蛋白激酶C 抑制劑鈣磷酸蛋白 C 能阻斷由毒胡蘿卜內(nèi)酯誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并伴隨成纖維細(xì)胞生長因子 21 mRNA 水平的下降。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能上調(diào) 3T3-L1 脂肪細(xì)胞成纖維細(xì)胞生長因子 21 mRNA 表達(dá)，且可被蛋白激酶C 抑制劑鈣磷酸蛋白C 阻斷。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激； 3T3-L1 細(xì)胞； 成纖維細(xì)胞生長因子 21

成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）家族共有 22 個成員，分為 7 個亞家族，其主要功能涉及胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、組織修復(fù)和腫瘤發(fā)生等[1-3]。2000年，Nishimura 等[4]首次從小鼠胚胎中分離得到 FGF21。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21 是 FGF 家族中的一個非典型性成員，其主要生物學(xué)功能是調(diào)節(jié)糖脂代謝[5-8]。

目前認(rèn)為，F(xiàn)GF21 主要在肝臟中表達(dá)，白色脂肪組織、胸腺、骨骼肌及胰島 β 細(xì)胞中也有少量表達(dá)[5,9-10]。臨床報告顯示，非酒精性脂肪肝、2 型糖尿病和肥胖等代謝疾病患者的血清 FGF21 水平顯著高于正常人群[11-13]。許多動物實驗也得到了類似的結(jié)果，與野生型小鼠相比，高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠和遺傳型肥胖小鼠的血清 FGF21 水平明顯升高，且在肝臟和白色脂肪組織中，F(xiàn)GF21 mRNA 水平呈高表達(dá)[7, 14-16]。這些研究結(jié)果表明在糖尿病和肥胖等病理狀態(tài)下，F(xiàn)GF21 濃度“應(yīng)激性”升高，提示這可能是一種反饋性調(diào)節(jié)，但具體調(diào)控機制尚未闡明。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中一種重要的細(xì)胞器，是蛋白質(zhì)合成、修飾的場所，參與糖類和脂類代謝，并維持細(xì)胞內(nèi)鈣平衡。但當(dāng)細(xì)胞受到缺氧、毒性藥物、感染等刺激時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白聚集，鈣離子平衡失調(diào)，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，這是機體的一種代償性過程，對細(xì)胞有保護(hù)作用。大量研究報道，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與肥胖、胰島素抵抗和糖尿病等代謝疾病密切相關(guān)?，F(xiàn)已證實，肥胖可以引起肝臟和脂肪組織發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[17-18]，同時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也是觸發(fā)胰島素抵抗和 2 型糖尿病的核心機制[19-21]。

然而，肥胖和糖尿病等代謝性疾病中 FGF21 的變化是否與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)尚未見報道。本研究用毒胡蘿卜內(nèi)酯（thapsigargin，TG）對已分化的脂肪細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，建立內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞模型，通過實時 PCR 檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78（glucose regulated protein 78，GRP78）和 C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）及 FGF21 的表達(dá)水平，為探討代謝性疾病中 FGF21 的調(diào)控機制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠前脂肪細(xì)胞株 3T3-L1 購于美國菌種保藏中心（ATCC）；高糖 DMEM 培養(yǎng)基、RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、實時 PCR 試劑盒購于美國 Invitrogen 公司；重組人胰島素、地塞米松（dexamethasone，Dex）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（isobutyl methylxanthine，IBMX）和毒胡蘿卜內(nèi)酯購于美國 Sigma 公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠 3T3-L1 脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)和分化 用含 10% FBS 的高糖 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)和維持 3T3-L1 前脂肪細(xì)胞，用經(jīng)典雞尾酒法誘導(dǎo)其分化。當(dāng)細(xì)胞長至接觸抑制 2 d 后，用分化液I（含 10 mg/L 胰島素、0.25 μmol/L Dex、0.5 mmol/L IBMX、10% FBS 的高糖 DMEM 培養(yǎng)基）培養(yǎng)2 d，再用分化液II（含 10 mg/L 胰島素、10% FBS 的高糖 DMEM 培養(yǎng)基）培養(yǎng) 2 d，之后用含 10% FBS 的高糖 DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每 2 天換液一次，分化8 ~ 9 d 后，分化率約為 90%，可用于下一步實驗。對分化成熟的 3T3-L1 細(xì)胞更換新鮮的完全培養(yǎng)基，然后用不同劑量 TG（0、6.25、12.5、25、50 和 100 nmol/L）處理 6 h 和用 100 nmol/L TG 處理不同時間（0、1、3、6 和12 h），以 DMSO 處理組作為對照，分別收集細(xì)胞，每組至少重復(fù) 3 次。

用 250 nmol/L 蛋白激酶C 抑制劑鈣磷酸蛋白C 預(yù)處理已分化的 3T3-L1 脂肪細(xì)胞 2 h，然后用 100 nmol/L TG 處理 6 h，以未處理組作為對照，收集細(xì)胞，至少重復(fù) 3 次。

1.2.2 實時 PCR 檢測 CHOP、GRP78 及 FGF21 的 mRNA 水平 用 Trizol 法提取總 RNA，260/280比值為 1.8 ~ 2.0，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成 cDNA。然后利用 SYBR 熒光實時 PCR 法檢測 CHOP、GRP78 和 FGF21 mRNA 相對表達(dá)量。實驗所用引物均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。以 β-actin 為內(nèi)參照基因，β-actin 引物序列：上游5' TGGAATCCTGTGGCATCCATGAA AC 3'；下游5' TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTC CG 3'。CHOP 引物序列：上游5' GCATGAAGGAG AAGGAGCAG 3'；下游5' CTTCCGGAGAGACAG ACAGG 3'。GRP78 引物序列：上游5' CAGATCTTCTCCACGGCTTC 3'；下游5' GCAGGAGGAATTC CAGTCAG 3'。FGF21 引物序列：上游5' CTGGGG GTCTACCAAGCATA 3'；下游5' CACCCAGGATT TGAATGACC 3'。反應(yīng)體系為 10 μl，包含 Power SYBR Green PCR Master Mix 5 μl，上游引物 0.2 μl，下游引物 0.2 μl，cDNA 模板 0.5 μl，ddH2O 4.1 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性 30 s，58 ℃退火 45 s，40 個循環(huán)。每個樣本設(shè) 3 個復(fù)孔，同時設(shè)無模板陰性對照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

反應(yīng)結(jié)束后，各個樣本的 Ct 值分別取平均數(shù)。以對照組的靶基因表達(dá)量為1，2-△△Ct即為實驗組相對對照組靶基因表達(dá)的倍數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度 TG 對 3T3-L1 脂肪細(xì)胞 FGF21、CHOP 和 GRP78 mRNA 表達(dá)的影響

分別用不同濃度 TG 處理 3T3-L1 脂肪細(xì)胞 6 h，以 DMSO 作為空白對照，用實時 PCR 檢測 FGF21、CHOP 和 GRP78 的 mRNA 表達(dá)水平。結(jié)果顯示，F(xiàn)GF21、CHOP 和 GRP78 mRNA 水平隨著劑量的升高呈遞增趨勢（圖 1），當(dāng) TG 濃度為 100 nmol/L 時，F(xiàn)GF21、CHOP 和 GRP78 mRNA達(dá)到最高，具有顯著性差異（< 0.05）。

2.2 TG 處理不同時間對 3T3-L1 脂肪細(xì)胞 FGF21、CHOP 和 GRP78 mRNA 表達(dá)的影響

100 nmol/L TG 處理 3T3-L1 脂肪細(xì)胞 1、3、6 和 12 h 后，收集細(xì)胞，實時 PCR 檢測 FGF21、CHOP 和 GRP78 的 mRNA 表達(dá)水平。如圖 2 所示，隨著處理時間的延長，F(xiàn)GF21、CHOP 和 GRP78 mRNA 表達(dá)水平上升，6 h 時達(dá)到峰值，12 h 后逐漸降低。處理 6 h，F(xiàn)GF21、CHOP 和 GRP78 mRNA 水平分別為對照組的 114.55、23.20和 12.33 倍，具有顯著性差異（< 0.05）。因此，在后面的實驗中我們選擇 100 nmol/L TG 處理 6 h 作為最佳處理條件。

2.3 蛋白激酶C 抑制劑鈣磷酸蛋白 C 對 TG 誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

250 nmol/L鈣磷酸蛋白 C 預(yù)處理 3T3-L1 脂肪細(xì)胞 2 h，然后再加入100 nmol/L TG 處理 6 h，收集細(xì)胞，實時 PCR 檢測 FGF21、CHOP 和GRP78 mRNA 的表達(dá)水平。如圖 3 所示，與對照組相比，TG 單獨處理組中，F(xiàn)GF21、CHOP 和GRP78 mRNA 水平顯著升高（< 0.05），這與前期實驗結(jié)果一致；與 TG 單獨處理組相比，鈣磷酸蛋白 C 預(yù)處理組中 FGF21、CHOP 和 GRP78 mRNA 水平顯著降低（< 0.05）。

FGF21 mRNA 相對水平FGF21 mRNA fold changes150 100 50 0 CHOP mRNA 相對水平CHOP mRNA fold changes30 20 10 0 0 0.25 12.5 25 50 100 0 0.25 12.5 25 50 100 TG 濃度（nmol/L）TG concentration (nmol/L)A TG 濃度（nmol/L）TG concentration (nmol/L)B

Figure 1 Effect of different doses of TG on mRNA levels of FGF21 (A), CHOP (B) and GRP78 (C) in the differentiated 3T3-L1 cells (*< 0.05)

FGF21 mRNA 相對水平FGF21 mRNA fold changes150 100 50 0 CHOP mRNA 相對水平CHOP mRNA fold changes30 20 10 0 0 1 3 6 12 0 1 3 6 12 時間（h）Time (h)A 時間（h）Time (h)B

Figure 2 Effect of TG on mRNA levels of FGF21 (A), CHOP (B) and GRP78 (C) after treatment for different time in the differentiated 3T3-L1 cells (*< 0.05)

FGF21 mRNA 相對水平FGF21 mRNA fold changes150 100 50 0 CHOP mRNA 相對水平CHOP mRNA fold changes30 20 10 0 對照組 TG 鈣磷酸蛋白 C + TG Control Calphostin C + TGA 對照組 TG 鈣磷酸蛋白 C + TG Control Calphostin C + TGB

Figure 3 Effect of PKC inhibitor on TG-induced mRNA levels in the differentiated 3T3-L1 cells (*< 0.05)

3 討論

FGF21 是一個與糖脂代謝有關(guān)的因子，臨床研究和動物實驗結(jié)果均顯示，肥胖和糖尿病等病理狀態(tài)下，F(xiàn)GF21 水平顯著升高，且與甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、胰島素等指標(biāo)呈正相關(guān)，F(xiàn)GF21 的升高被認(rèn)為是一種反饋性上調(diào)，但具體的分子機制未見報道。

文獻(xiàn)報道，肥胖中脂質(zhì)過量堆積、胞內(nèi)能量流動和養(yǎng)分利用障礙會誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[17, 22]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活的 IRE1α-JNK 信號通路會導(dǎo)致胰島素受體及其底物功能障礙，這是發(fā)生胰島素抵抗的重要原因[17, 23]。持續(xù)的胰島素抵抗會促使胰島素不斷合成和分泌，進(jìn)而引起胰島 β 細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生代償性擴張，蛋白質(zhì)合成增加，導(dǎo)致未成熟的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累，進(jìn)一步加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，最終使 β 細(xì)胞衰竭，引發(fā) 2 型糖尿病。由此可見，肥胖、胰島素抵抗和糖尿病中均存在不同程度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與這些代謝疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

TG 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜 Ca2+-ATP 酶抑制劑，誘導(dǎo)胞漿內(nèi) Ca2+濃度上升和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲存鈣的下降，從而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。本實驗應(yīng)用 TG 處理體外分化培養(yǎng)的 3T3-L1 脂肪細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志分子 GRP78 和 CHOP mRNA 水平隨 TG 濃度的增加和作用時間的延長而逐漸增高，表明成功構(gòu)建了 3T3-L1 脂肪細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型。同時，F(xiàn)GF21 的 mRNA 水平也隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激加劇而升高。當(dāng)用 100 nmol/L TG 處理 6 h 后，F(xiàn)GF21 的 mRNA 水平為對照組的 114.55 倍，與對照組有顯著性差異，但是 12 h 后，表達(dá)水平又有所下降，這可能是由于處理時間過長，TG 對細(xì)胞產(chǎn)生了一定的毒性。而與 TG 處理組相比，蛋白激酶C 抑制劑鈣磷酸蛋白 C 預(yù)處理阻斷了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，CHOP 和 GRP78 的 mRNA 水平顯著降低，同時伴隨 FGF21 mRNA 水平的降低。表明在分化的 3T3-L1脂肪細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激上調(diào)了 FGF21 表達(dá)，提示在肥胖和糖尿病等代謝性疾病中 FGF21 水平的升高可能是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的。同時，TG 是一種典型的 Ca2+釋放劑，而胞內(nèi)高濃度 Ca2+會活化蛋白激酶C，我們推測 FGF21 的調(diào)控可能與 Ca2+介導(dǎo)的信號通路密切相關(guān)，具體機制有待進(jìn)一步研究。

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Effect of endoplasmic reticulum stress on FGF21 mRNA expression in the differentiated 3T3-L1 cells

WAN Xiao-shan, LIU Yan-long, ZHANG Yi, XIAO Ye-chen, ZHANG Hai-miao, XU Zhu-mei, XIAO Jian

To study the effect of endoplasmic reticulum stress on FGF21 expression in the differentiated 3T3-L1 cells.

3T3-L1 pre-adipocytes were culturedand differentiated into adipocytes, and then treated with different concentrations of thapsigargin (TG) (0, 6.25, 12.5, 25, 50 and 100 nmol/L) for 6 h or 100 nmol/L TG for different time (0, 1, 3, 6 and 12 h). The mRNA levels of CHOP, GRP78 and FGF21 were detected using real time PCR.

TG-induced endoplasmic reticulum stress increased mRNA expression of CHOP,GRP78 and FGF21 in a dose- and time- dependent manner. FGF21 mRNA expression in 3T3-L1 adipocytes treated by 100 nmol/L TG for 6 h was significantly higher than that of control group (< 0.05). PKC inhibitor calphostin C markedly inhibited TG-induceed endoplasmic reticulum stress, and reduced FGF21 mRNA expression.

FGF21 mRNA expression can be up-regulated by endoplasmic reticulum stress, which can be inhibited by PKC inhibitor calphostin C.

Endoplasmic reticulum stress; 3T3-L1 cells; Fibroblast growth factor 21

XU Zhu-mei, Email: profxzm2008@126.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.06.004

國家自然科學(xué)基金（81170813、81300311）；浙江省自然科學(xué)基金（Y2100048、LY12H03001、LQ13H280002）；浙江省重點科技創(chuàng)新團(tuán)隊項目（2010R50042）

許竹梅，Email：profxzm2008@126.com

2014-03-26

Author Affiliations: School of Pharmacy, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China (WAN Xiao-shan, LIU Yan-long, ZHANG Yi, XIAO Ye-chen, XU Zhu-mei, XIAO Jian); BGI Wuhan, Wuhan 430075, China (ZHANG Hai-miao)