汪書越 李玲竹 苗艷穎 王中峰

大麻因具有治療和精神作用而被吸食應(yīng)用達(dá)上千年之久。大麻是?？浦参锎舐?cannabis sativa)的提取物，其有效活性成分是四氫大麻酚(Δ9-tetrahydrocannabinol，Δ9-THC)。自從發(fā)現(xiàn)Δ9-THC后，一系列與其功能相似的化合物被合成，這些化合物統(tǒng)稱為大麻素(cannbinoids)。在大麻素的研究過程中，一個(gè)重要的進(jìn)展是在動物組織中發(fā)現(xiàn)大麻素的受體(cannbinoid receptor)。大麻素受體主要有CB1和CB22個(gè)亞型，均是7次跨膜的G蛋白耦聯(lián)受體，二者的氨基酸序列有44%的同源性［1］。CB1受體主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而CB2受體主要分布在免疫系統(tǒng)［2］。大麻素研究歷程中的另一個(gè)重要進(jìn)展是內(nèi)源性大麻素(endocannbinoid，eCB)，即大麻素受體的內(nèi)源性配體的發(fā)現(xiàn)。有代表性的內(nèi)源性大麻素有2類:N-花生四烯酸氨基乙醇(arachidonylethablamide，anandamine，AEA)和 2-花生四烯酸甘油(2-arachidonyl glycerol，2-AG)。已有文獻(xiàn)［3-4］表明，廣泛表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)，通過作用于大麻素受體，調(diào)控多種生理功能，如影響學(xué)習(xí)記憶、痛覺感知、突觸傳遞和突觸可塑性等。

越來越多的證據(jù)［5-6］表明，大麻素受體信號系統(tǒng)在脊椎動物視網(wǎng)膜中有廣泛分布。通過種屬特異的多克隆抗體，在人、獼猴、小鼠、大鼠、雞、金魚和虎螈的視網(wǎng)膜中均發(fā)現(xiàn)有CB1受體的表達(dá)［7-8］。大麻素受體的內(nèi)源性配體AEA［9］和內(nèi)源性大麻素水解酶脂肪酸酰胺水解酶(fatty acid amide hydrolase，F(xiàn)AAH)，在多種視網(wǎng)膜細(xì)胞上和內(nèi)網(wǎng)狀層上均有表達(dá)［7-8，10］。這些結(jié)果提示，內(nèi)源性大麻素可能調(diào)控多種視網(wǎng)膜神經(jīng)元的功能，并且在視覺信息處理的多種神經(jīng)回路中起作用。神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是視網(wǎng)膜的唯一輸出神經(jīng)元，它整合視網(wǎng)膜的視覺信息，以動作電位的方式將信息輸送至視覺中樞。盡管有研究［5-6］發(fā)現(xiàn)，多種動物視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞有大麻素受體的表達(dá)，但對于CB1和CB2受體在大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞上的分布特征和意義尚沒有完全闡釋清楚。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)等方法研究大麻素CB1、CB2受體在出生后1周、4周和12周大鼠視網(wǎng)膜組織，尤其是神經(jīng)節(jié)細(xì)胞上的表達(dá)和分布情況，為進(jìn)一步研究大麻素信號系統(tǒng)在視網(wǎng)膜網(wǎng)絡(luò)組織的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 出生后1周、4周和 12周雄性Sprague-Dawley大鼠，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物中心，清潔級。本實(shí)驗(yàn)所有動物實(shí)驗(yàn)均遵守美國眼科與視覺研究協(xié)會(ARVO)和復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)管理及動物使用規(guī)定。實(shí)驗(yàn)中盡量減輕動物疼痛和不適，飼養(yǎng)溫度維持在21℃，12 h光照/黑暗循環(huán)照明，給予充足的水、飼料和活動空間。

1.2 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的上丘逆行追蹤標(biāo)記 參照先前的實(shí)驗(yàn)［11］進(jìn)行。采用了在上丘注射霍亂毒素B亞基(cholera toxin subunit B，CTB)(List Biological Laboratories，USA)作為追蹤物的方法來逆行標(biāo)記視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。具體操作如下:大鼠后肢肌內(nèi)注射氯氨酮(25 mg/kg)和甲苯噻嗪(10 mg/kg)混合劑全身麻醉后，上好耳桿，然后將其頭部固定在立體定位儀(SR-6R，Narishige，Tokyo，Japan)上，全程注意監(jiān)測其呼吸和體溫。用0.5%聚維酮碘消毒皮膚，于正中切開皮膚，向下分離達(dá)顱骨，暴露顱骨，在骨縫交合處尋找Bregma點(diǎn)，然后以Bregma點(diǎn)向后6 mm、旁開2 mm、4～5 mm深度的位置定位上丘。用骨鉆在雙側(cè)上丘相對應(yīng)顱骨處小心打孔。用微量注射器在上丘位置分別注入2 μL 1%的 CTB溶液。緩慢注射，在6 min內(nèi)完成。然后，緩慢取出微量注射器，用凝膠海綿堵塞顱骨上的鉆孔，消毒并縫合顱頂皮膚。在逆行標(biāo)記第5～6天處死動物，取出眼球，固定后切片。

1.3 視網(wǎng)膜標(biāo)本制備 參考之前的工作［11-12］進(jìn)行。用25%烏拉坦腹腔注射深度麻醉大鼠，迅速摘取眼球，浸入4%多聚甲醛溶液中，4℃固定2 h。依次在10%和20%蔗糖溶液中分別浸泡2 h，30%蔗糖溶液中4℃過夜梯度脫水。最后在角鞏膜緣下約2 mm處環(huán)形切開，眼科剪環(huán)剪1周。棄去角膜、晶狀體以及玻璃體的前半部分，將眼杯用最佳切削溫度(optimal cutting temperature，OCT)(Miles Inc.，Elkhart，IN，USA)包埋劑包埋，再在冰凍切片機(jī)(Leica，Nussloch，Germany)沿垂直方向進(jìn)行連續(xù)切片，片厚14 μm，依次收集于經(jīng)預(yù)處理的玻片(Fisher，USA)上，儲存于－20℃冰箱備用。

1.4 免疫熒光組織化學(xué) 將切片從－20℃冰箱取出，恢復(fù)至室溫后用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffered saline，PBS)漂洗5 min×3次。之后，置于含有3%正常驢血清、0.5%小牛血清和0.2%Triton X-100的PBS置于室溫孵育2 h，以降低非特異性背景染色。然后加入一抗反應(yīng)液，置于4℃冰箱孵育過夜。次日，用PBS漂洗10 min×3次以充分洗去未結(jié)合的一抗，加入對應(yīng)的二抗，室溫孵育2 h后，PBS漂洗3×15 min后，加入DAPI(1∶1000，Sigma)封片劑封片。在實(shí)驗(yàn)中用到的一抗有:羊抗 CTB多克隆抗體 (1∶2000，List Biological Laboratories，USA)，小鼠抗Brn3單克隆抗體(1∶100，Santa Cruz，USA)，兔抗 CB1 受體多克隆抗體(1∶300，Abcam，USA)和兔抗CB2受體多克隆抗體(1∶200，Sigma，USA)。二抗有488-耦聯(lián)的驢抗羊或驢抗 鼠 IgG (1∶800，Jackson Immuno Research Laboratories，USA)和 Cy3-耦聯(lián)的驢抗兔 IgG(1∶200，Jackson Immuno Research Laboratories，USA)。

經(jīng)過免疫熒光反應(yīng)的視網(wǎng)膜切片在共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察(Olympus，放大400倍)。對準(zhǔn)備好的標(biāo)本進(jìn)行單層光學(xué)切片掃描并數(shù)字化記錄，數(shù)據(jù)保存到電腦上。為了避免由于重塑產(chǎn)生疊加偽跡的可能性，在雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)中對單層光學(xué)切片進(jìn)行次第掃描。所得到的圖片用Adobe Photoshop軟件加以適當(dāng)?shù)恼{(diào)整和標(biāo)注。

1.5 Western印跡法分析 迅速分離大鼠視網(wǎng)膜或者腦組織，加適量RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑和含有磷酸酶抑制劑的 cocktail(Roche Applied Science，Mannheim，Germany)。經(jīng)超聲破碎儀(ultrasonic cell prosessor，Ningbo，China)破碎細(xì)胞后，以相對離心力15294×g，4℃ 離心30 min。收集離心后蛋白上清液，按4∶1加入5×上樣緩沖液，煮沸6 min后，迅速放冰上冷卻后于-40℃?zhèn)溆?。將已制備好的蛋白樣品加?0%SDS-PAGE上的梳孔中，然后利用Mini-PROTEAN 3電泳系統(tǒng)(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)在120 V恒壓條件下電泳90 min左右，從而將視網(wǎng)膜蛋白按相對分子質(zhì)量大小在PAGE上依次分離開，在分離膠左上角做標(biāo)記。之后再用 Mini Trans-Blot電轉(zhuǎn)系統(tǒng)(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)在恒流300 mA條件下轉(zhuǎn)膜2 h，將蛋白從 PAGE上轉(zhuǎn)印到 PVDF膜(Immobilon-P，Millipore，Billerica，Massachusetts，USA)上。待轉(zhuǎn)印完成之后，用封閉液(含5%脫脂奶粉和0.05%Tween 20的TBS)室溫下封閉轉(zhuǎn)移后的 PVDF膜1 h。用1×TBST溶液適當(dāng)漂洗之后，將PVDF膜轉(zhuǎn)移到待檢目的蛋白的抗體反應(yīng)液中，置4℃孵育過夜。次日，用1×TBST溶液漂洗3次之后，加入二抗并在室溫下孵育2 h。將二抗在1×TBST溶液漂洗3次，每次15 min后，將 PVDF膜用 Alpha凝膠成像儀 FluorChemE(ProteinSimple，USA)進(jìn)行掃描并且獲得圖像。實(shí)驗(yàn)中用到的一抗為單克隆鼠抗β-actin(1∶1000，Sigma，USA);兔抗CB1受體多克隆抗體 (1∶300，Abcam，USA);兔抗 CB2受體多克隆抗體 (1∶250，Sigma，USA);二抗為IRDye 800CW 驢抗兔IgG(1∶10000;LI-COR Biosciences，USA)和 IRDye 800CW 驢抗鼠IgG(1∶10000;LI-COR Biosciences，USA)。

2 結(jié)果

2.1 CB1受體在成年大鼠視網(wǎng)膜的表達(dá)與分布 在成年(4周齡)大鼠視網(wǎng)膜垂直切片的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，CB1受體的免疫熒光信號(紅色)廣泛分布于視網(wǎng)膜(圖1A)。在外核層(outer nuclear layer，ONL)、內(nèi)核層(inner plexiform layer，INL)和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(ganglion cell layer，GCL)，CB1受體陽性信號較強(qiáng)，且與細(xì)胞核的DAPI信號(藍(lán)色)重疊，說明這些CB1受體表達(dá)在細(xì)胞上;在突觸豐富的外網(wǎng)狀層(outer plexiform layer，OPL)和內(nèi)網(wǎng)狀層(inner plexiform layer，IPL)也有較多的CB1受體陽性信號，說明在視網(wǎng)膜的細(xì)胞突起上也有CB1受體分布(圖1A)。當(dāng)CB1受體的抗體被相應(yīng)的免疫抗原(Abcam，Cambridge，MA，USA)預(yù)先結(jié)合后，則檢測不到任何陽性熒光信號(圖1B)，表明我們所用CB1受體的抗體是特異的。

在CTB逆行標(biāo)記的大鼠視網(wǎng)膜垂直切片中，利用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，GCL的CTB陽性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(綠色，圖1C)均被CB1受體的抗體所共標(biāo)(紅色，圖1D)。從疊加后的圖中可以清楚地看到，CTB所標(biāo)記的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞全都是CB1受體免疫陽性的(如圖1E中的4個(gè)小箭頭所示)。此外，我們也觀察到，有些CTB陰性的神經(jīng)細(xì)胞也同樣是CB1受體陽性的(如圖1E中的大箭頭所示)，這些細(xì)胞可能是異位的無長突細(xì)胞。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證CB1受體在大鼠視網(wǎng)膜的表達(dá)，我們利用Western印跡法檢測了大鼠視網(wǎng)膜CB1受體蛋白的表達(dá)。如圖1F所示，視網(wǎng)膜組織抽提蛋白的Western印跡法結(jié)果呈單一條帶(約45×103)。同時(shí)，我們用大鼠的大腦皮質(zhì)蛋白提取物進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)，也得到了相同的單一條帶。這些結(jié)果證明了大鼠視網(wǎng)膜組織表達(dá)CB1受體，而且也證明了我們所用的CB1受體抗體的特異性。

圖1.大麻素CB1受體在大鼠視網(wǎng)膜的表達(dá)和分布

2.2 CB2受體在成年大鼠視網(wǎng)膜的表達(dá)與分布 大鼠視網(wǎng)膜垂直切片的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，CB2受體的免疫熒光信號(紅色)在視網(wǎng)膜各層均有分布(圖2A)，其中在GCL、INL和ONL的細(xì)胞膜上有豐富的陽性信號，而且OPL和IPL也有廣泛的CB2受體陽性信號。此外，在Müller膠質(zhì)細(xì)胞的終足和突起上也觀測到CB2受體的陽性信號(圖2A)。當(dāng)用相應(yīng)的免疫抗原(Abcam，Cambridge，MA，USA)預(yù)吸附CB2受體的抗體，則在視網(wǎng)膜組織檢測不到任何CB2受體的陽性熒光信號(圖2B)，證明了所用的CB2受體抗體的特異性。

在CTB逆行標(biāo)記的大鼠視網(wǎng)膜垂直切片上，利用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在GCL所有CTB標(biāo)記的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(綠色，圖2C)，均可被CB2抗體標(biāo)記(紅色，圖2D)。圖2E顯示兩者疊加后的圖像，可清楚看到，CTB所標(biāo)記的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞全都是CB2受體免疫陽性的(如圖2E中的小箭頭所示)。在GCL中個(gè)別CTB陰性的細(xì)胞也可被CB2受體抗體標(biāo)記，這些細(xì)胞可能是異位的無長突細(xì)胞。

Western印跡法結(jié)果顯示，大鼠視網(wǎng)膜和大腦皮質(zhì)組織均有CB2受體蛋白的表達(dá)，而且呈單一的條帶，證明了其抗體的特異性(圖2F)。

圖2.大麻素CB2受體在大鼠視網(wǎng)膜的表達(dá)和分布

2.3 CB1和CB2受體在幼年和老齡大鼠視網(wǎng)膜的表達(dá)與分布 進(jìn)一步觀察了CB1和CB2受體在幼年(1周齡)和老齡(12周齡)大鼠視網(wǎng)膜組織的表達(dá)分布。如圖3A和3E所示，1周齡大鼠視網(wǎng)膜垂直切片的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，CB1和CB2的免疫熒光信號(紅色)在視網(wǎng)膜各層均有分布，包括GCL、INL和ONL的細(xì)胞膜，以及OPL和IPL。由于在新生低齡大鼠的上丘注射CTB逆行標(biāo)記視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存在困難，我們用神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的特異標(biāo)記物Brn3取代CTB來標(biāo)記視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。利用免疫雙標(biāo)技術(shù)，在1周齡大鼠視網(wǎng)膜垂直切片上發(fā)現(xiàn)，GCL的Brn3陽性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(綠色，圖3B和3F)均被CB1或CB2受體的抗體所共標(biāo)(紅色，圖3C和3G)。圖3D和3H顯示的是疊加后的圖片，可以清楚地看到Brn3所標(biāo)記的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞幾乎都是CB1或CB2受體免疫陽性的(如圖3D和3H中的小箭頭所示)。

在視網(wǎng)膜垂直切片的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，CB1/CB2受體在老齡大鼠視網(wǎng)膜的表達(dá)分布與幼年和成年大鼠的相似，即在視網(wǎng)膜各細(xì)胞層(GCL、INL和ONL)以及突觸層(IPL和OPL)廣泛表達(dá)(紅色信號)(圖4A和4E)。在CTB逆行標(biāo)記的12周齡大鼠視網(wǎng)膜垂直切片上，免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在GCL幾乎所有CTB標(biāo)記的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(綠色，圖4B和4F)，均可被CB1或CB2抗體標(biāo)記(紅色，圖4C和4G)。從兩者疊加的圖4D和4H可清楚看到，CTB所標(biāo)記的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞幾乎都是CB1或CB2受體免疫陽性的(如圖4D和4H中的小箭頭所示)。

圖3.大麻素CB1和CB2受體在幼年(1周齡)大鼠視網(wǎng)膜的表達(dá)和分布

圖4.大麻素CB1和CB2受體在老齡(12周齡)大鼠視網(wǎng)膜的表達(dá)和分布

3 討論

本文的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大麻素受體的2個(gè)亞型(CB1和CB2)在幼年、成年和老齡大鼠視網(wǎng)膜組織豐富表達(dá)和分布，幾乎所有的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞均表達(dá)2種受體亞型，提示大麻素系統(tǒng)可能對神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的功能活動有重要的調(diào)控作用。

CB1受體在視網(wǎng)膜中最早的細(xì)胞定位是通過原位雜交方法在胚胎大鼠視網(wǎng)膜實(shí)現(xiàn)的，CB1受體mRNA在多種視網(wǎng)膜細(xì)胞上均有表達(dá)［13］，之后，在雞胚胎視網(wǎng)膜也發(fā)現(xiàn)有CB1受體mRNA的表達(dá)。通過種屬特異的多克隆抗體發(fā)現(xiàn)，CB1受體表達(dá)在人、獼猴、小鼠、大鼠、雞、金魚和虎螈的視網(wǎng)膜大多數(shù)細(xì)胞及OPL和IPL。針對神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，CB1受體在除了魚以外的其他幾個(gè)物種視網(wǎng)膜上均有表達(dá)［7］。然而，關(guān)于CB1受體在大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞表達(dá)的報(bào)道不盡一致。Yazulla等［8］報(bào)道，成年大鼠視網(wǎng)膜GCL細(xì)胞的胞體沒有檢測到CB1陽性信號，盡管在IPL的遠(yuǎn)端有點(diǎn)狀陽性信號，但無法分辨細(xì)胞類型;其他實(shí)驗(yàn)室則發(fā)現(xiàn)，CB1受體在從新生到成年的大鼠神經(jīng)節(jié)細(xì)胞均有表達(dá)［6-7］，與此一致，我們利用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)，在幼年、成年和老齡大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的胞體和突起上發(fā)現(xiàn)CB1受體的表達(dá)，而且在GCL，一些異位的無長突細(xì)胞也表達(dá)CB1受體。造成這種差異的原因可能是他們所用的抗體不同。Yazulla等［8］所用抗體是識別胞外C1-C14序列，而Zabouri等［6］的抗體是識別C1-C77序列。在本文中，我們所用的抗體是識別胞內(nèi)416-472序列。

關(guān)于CB2受體在視網(wǎng)膜表達(dá)和分布的研究相對較少。盡管利用原位雜交技術(shù)在胚胎大鼠視網(wǎng)膜沒有檢測到CB2受體 mRNA的存在［13］，但后續(xù)的研究利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和原位雜交技術(shù)在成年小鼠和大鼠視網(wǎng)膜檢測到廣泛分布的CB2受體mRNA［14］。最近，利用免疫組織化學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠視網(wǎng)膜色素上皮、光感受器細(xì)胞內(nèi)側(cè)片段、水平細(xì)胞、無長突細(xì)胞、GCL中的細(xì)胞和IPL的纖維上都有CB2受體的存在［15］。與此一致，我們也發(fā)現(xiàn)在幼年、成年和老齡大鼠視網(wǎng)膜有廣泛分布的CB2受體，而且從出生到老齡，其表達(dá)和分布相似，提示在出生后早期這些受體的發(fā)育已經(jīng)基本完成。鑒于視網(wǎng)膜GCL細(xì)胞有較多的異位無長突細(xì)胞，我們利用CTB逆行標(biāo)記或Brn3標(biāo)記神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，并利用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)，觀察到幾乎所有的大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞均表達(dá)CB2受體。

已有的研究［5］表明，在視網(wǎng)膜廣泛分布、激活的CB1受體對多種神經(jīng)元的離子通道有抑制作用，可以調(diào)控視網(wǎng)膜對光信號的加工和處理。然而，有關(guān)CB1受體對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞功能的調(diào)控，目前資料還不多。利用膜片鉗技術(shù)在培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)節(jié)細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)，CB1受體激動劑濃度依賴性壓抑高電壓激活的鈣離子通道電流［10］。此外，激活CB1受體也對視網(wǎng)膜產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。例如:大麻素抑制人眼活化狀態(tài)的Müller細(xì)胞促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放，并提高抗炎介質(zhì)的產(chǎn)生［16］;CB1受體激動劑可以保護(hù)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞免受谷氨酸毒性的侵害以及由高眼壓造成的缺血和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目的減少［17］。因此，進(jìn)一步研究大麻素受體對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞功能的調(diào)控，將有助于理解視覺信息在視網(wǎng)膜的加工和處理，以及該受體系統(tǒng)對視網(wǎng)膜神經(jīng)元保護(hù)的機(jī)制。

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