季峰等

【摘要】 目的：探討ETV1在胃腸道間質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及臨床意義。方法：應(yīng)用免疫組化、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western-blot檢測(cè)ETV1在135例不同胃腸道間質(zhì)瘤患者的腫瘤組織及瘤旁組織中的表達(dá)。結(jié)果：免疫組化結(jié)果顯示，ETV1在胃腸道間質(zhì)瘤中陽性表達(dá)率為68.1%，顯著高于瘤旁正常組織的5.2%（P<0.05）。熒光定量PCR方法顯示，間質(zhì)瘤組織中ETV1的相對(duì)表達(dá)Ct值（3.30±2.37）低于瘤旁正常組織的（6.19±2.86），腫瘤組織中ETV1的表達(dá)是正常組織的7.41倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。Western-blot法檢測(cè)顯示，ETV1蛋白在胃腸道間質(zhì)瘤中的表達(dá)水平（1.24±0.67）也較瘤旁正常組織高（0.88±0.28）（P=0.0369）；Pearson相關(guān)分析顯示，ETV1mRNA和蛋白水平呈正相關(guān)（r=0.526，P=0.017）。結(jié)論：ETV1在胃腸道間質(zhì)瘤中特異性高表達(dá)，可能與胃腸道間質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，有望成為新的腫瘤標(biāo)志物，為臨床治療提供新靶點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】 胃腸道間質(zhì)瘤； 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子； 腫瘤發(fā)生

【Abstract】 Objective：To investigate the expression of ETV1 in gastrointestinal stromal tumors and its clinical significance.Method：Surgical gastrointestinal stromal tumor tissues and adjacent normal mucosa were obtained from 135 patients with gastrointestinal stromal tumor.Immunohistochemistry was conducted to detect the distribution of ETV1 protein，while the quantitative real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction and Western blot method were used to detect the expressions of ETV1 mRNA and protein.Result：Immunohistochemical analysis showed the positive rate of ETV1 expression was 68.1% in gastrointestinal stromal tumor tissues，it was significantly higher than 5.2% in the adjacent normal samples（P<0.05）.Fluorescence quantitative polymerase chain reaction （PCR） showed that relative expression of Ct value was （3.30±2.37）in gastrointestinal stromal tumor tissues，it was significantly lower than （6.19±2.86） in adjacent normal samples，expression of ETV1 in tumor tissue was 7.41 times of normal tissue，the difference was statistically significant（P<0.001）.Western blot analysis revealed that the expression of ETV1 protein was （1.24±0.67） in gastrointestinal stromal tumor tissues，it was significantly higher than （0.88±0.28） in normal colorectal tissues （P=0.0369）.Pearson correlation analysis showed that the mRNA level was in positive correlation with the protein level（r=0.526，P=0.017）.Conclusion：The specific expression of the ETV1 is in a correlation with the pathogenesis of gastrointestinal stromal tumor.ETV1 is expected to be a new tumor marker and the new target for clinical therapy.

【Key words】 Gastrointestinal stromal tumor； Transcription regulatory factors； Tumorigenesis

First-authors address：The First Affiliated Hospital of Zhejiang University Medical College，Hangzhou 310000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.25.001

ETS家族是最大的信號(hào)依賴轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族之一，其過度表達(dá)和許多人類腫瘤發(fā)生有關(guān)，近年來已成為各國學(xué)者關(guān)注的重點(diǎn)。ETS變異體1（ETV1，ER81）是ETS家族成員之一。已有研究表明，ETV1在乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、尤文氏瘤中過度表達(dá)，參與腫瘤的形成和發(fā)展[1-5]。國外已有研究發(fā)現(xiàn)，ETV1在胃腸道間質(zhì)瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）細(xì)胞中存在普遍高表達(dá)[6]，但是國內(nèi)鮮有相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western-blot方法檢測(cè)GIST及瘤旁正常組織中ETV1的表達(dá)，探索其表達(dá)差異的意義。endprint

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選取本院2012年5月-2014年1月經(jīng)手術(shù)治療的GIST患者135例。其中男68例，女67例，年齡24～83歲，平均（58.7±11.8）歲，中位年齡59歲。腫瘤發(fā)生部位包括胃104例，小腸24例，其他部位7例。所有手術(shù)病例均為初治，術(shù)前均未行放、化療或伊馬替尼等分子靶向治療。GIST標(biāo)本取自病灶中央無壞死部分，另取距腫瘤邊緣大于3 cm的瘤旁正常組織，離體后立即切成大約0.5 cm小塊，于10 min內(nèi)放于液氮中保存，后轉(zhuǎn)存于-80 ℃冰箱。部分標(biāo)本用4%甲醛固定，石蠟包埋，做免疫組化染色。所有標(biāo)本均經(jīng)過病理科醫(yī)師證實(shí)為GIST。本實(shí)驗(yàn)獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。

1.2 免疫組化染色 組織石蠟包埋制成厚約4 μm組織切片，常規(guī)HE染色和免疫組化染色。每批染色均用已知陽性切片做陽性對(duì)照，用PBS代替一抗做陰性對(duì)照。結(jié)果判定：以胞質(zhì)、胞核或胞膜染有均勻棕黃色顆粒、染色強(qiáng)度高于背景非特異性染色者為陽性細(xì)胞。采用雙盲法，選取5個(gè)高倍視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。按半定量評(píng)分方法進(jìn)行計(jì)算：根據(jù)每視野著色細(xì)胞占總細(xì)胞的數(shù)目（陽性細(xì)胞0、1%～25%、26%～50%、>50%）分別記為0、1、2、3分；按每張切片著色細(xì)胞的染色強(qiáng)度（陰性、弱、中、強(qiáng)）分別記為0、1、2、3分；根據(jù)兩項(xiàng)評(píng)分之和判斷結(jié)果：≤2分為陰性，≥3為陽性。

1.3 RT-PCR檢測(cè)ETV1 mRNA表達(dá)

1.3.1 總RNA提取 稱取100 mg組織，勻漿后用TRIzol法進(jìn)行GIST組織及瘤旁組織的總RNA提取。紫外分光光度計(jì)定量并檢測(cè)其純度，A260/A280比值在1.8～2.0。按照Takara PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）試劑盒（Takara公司）說明書步驟將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR ETV1正向引物為

5-GCAGTCAAGAACAGCCCTTTA-3，反向引物為

5-TCAGGTTTCGGTGTATGAGTTG-3。以GAPDH為內(nèi)參照，其正向引物為5-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3，反向引物為5-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3。取cDNA 1 μL，按照SYBR? Premix Ex Taq? （Tli RNaseH Plus）試劑盒（Takara公司）說明書步驟進(jìn)行反應(yīng)，95 ℃預(yù)變性30 s，隨后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)（95 ℃變性5 s，60 ℃退火與延伸34 s）。腫瘤組織與正常組織的相對(duì)表達(dá)Ct值，即?Ct=Ct（ETV1）-Ct（GAPDH）。腫瘤組織中ETV1表達(dá)相對(duì)于瘤旁正常組織的倍數(shù)用2-??Ct計(jì)算。

1.4 Western blot法檢測(cè)ETV1蛋白表達(dá) 取100 mg新鮮組織，將組織粉碎后加入裂解液提取總蛋白，4 ℃離心10 min，提取上清液，BCA法測(cè)定蛋白含量。在提取出的蛋白中加入適量5×上樣緩沖液煮沸10 min。取等量樣本于10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，與兔抗人ETV1單克隆抗體或GAPDH單克隆抗體4 ℃孵育過夜，洗膜，與辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔多克隆抗體室溫孵育1 h，洗膜。用ECL顯色曝光。組織中不同蛋白表達(dá)水平用目的條帶與內(nèi)參GAPDH條帶的灰度值比值定量表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，采用 字2檢驗(yàn)，Kruskal—Wallis等級(jí)相關(guān)采用Spearman方法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ETV1的免疫組化染色結(jié)果 ETV1免疫組化陽性染色產(chǎn)物位于細(xì)胞核。ETV1在GIST中普遍高表達(dá)，陽性率達(dá)68.1%（92/135），但是在瘤旁正常組織基本不表達(dá)，為5.2%（7/135），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖1。

3 討論

GIST是消化系統(tǒng)最常見的間葉源性腫瘤，它主要是由c-kit或者PDGFRA基因致瘤突變導(dǎo)致，發(fā)病率約為1/10萬～2/10萬人，近年來呈明顯增加的趨勢(shì)。伊馬替尼等分子靶向藥物的應(yīng)用，極大地提高了GIST的藥物療效。但是，伊馬替尼的成功應(yīng)用并未根除間質(zhì)瘤，腫瘤復(fù)發(fā)和耐藥成為影響療效的關(guān)鍵因素[7-8]。因此，探索GIST表面分子特性，尋找新的分子靶標(biāo)已成為目前GIST診治研究的熱點(diǎn)。

ETS家族是最大的信號(hào)依賴轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族之一，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)30多個(gè)ETS家族成員，它們均含有一個(gè)由85個(gè)氨基酸組成的特異DNA結(jié)合區(qū)（ETS區(qū)），該區(qū)與靶基因啟動(dòng)區(qū)一個(gè)富含嘌呤的序列GGAA/T結(jié)合后調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。ETV1是ETS家族成員之一，ETV1及其相關(guān)ETS轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控多能祖細(xì)胞分化，在組織發(fā)育過程中差異表達(dá)，過度表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞惡性改變[9-10]。在一些腫瘤中ETV1基因參與某些染色體易位突變，基因融合產(chǎn)生嵌合體蛋白導(dǎo)致細(xì)胞惡性變，被認(rèn)為是促使腫瘤發(fā)生的主要因素之一，如前列癌中ETV1和跨膜絲氨酸蛋白酶2基因的融合、尤文氏肉瘤中ETV-1和EWS基因的融合[1，5]。前列腺癌中過度表達(dá)的ETV1也可以和雄激素受體作用促成腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[11]。其他腫瘤如黑色素瘤、乳腺癌中也存在ETV1蛋白過度表達(dá)，在調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖中起重要作用[2-4]。進(jìn)一步研究表明，ETV1對(duì)靶基因的作用由復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行調(diào)節(jié)。各種信號(hào)激活Ras/Raf/MAPK信號(hào)通路是調(diào)控ETV1的主要途徑[2，12-13]。Ras/Raf/MAPK通路的激活導(dǎo)致ETS轉(zhuǎn)錄因子活化，從而調(diào)控生長和周期相關(guān)基因，如c-myc、junB、cdc2和cyclinD139[14]。在ETS的參與作用下，Ras信號(hào)成功轉(zhuǎn)化成一系列生長、凋亡相關(guān)基因。在前列腺癌、黑色素瘤中，Ras-MAPK-ETV1通路進(jìn)一步得到了驗(yàn)證，Ras-MAPK的激活是調(diào)控ETV1的主要途徑[2，12-13]。Chi等[6]研究發(fā)現(xiàn)，ETV1在伊馬替尼敏感或耐藥GIST細(xì)胞中普遍表達(dá)，且ETV1在GIST中的表達(dá)水平明顯高于其他腫瘤，如胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、黑色素瘤、卵巢癌等。ETV1能夠與KIT協(xié)同作用，調(diào)控GIST細(xì)胞的增殖凋亡與惡性轉(zhuǎn)變。endprint

本研究結(jié)果表明，ETV1在GIST組織中的基因和蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)，在瘤旁正常組織很少表達(dá)，與Chi等[6]研究結(jié)果符合。該結(jié)果提示ETV1在GIST中特異性表達(dá)，可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性。但是否將ETV1的表達(dá)作為評(píng)估腫瘤惡性程度及預(yù)測(cè)發(fā)展仍有待進(jìn)一步研究。深入探索ETV1在GIST發(fā)生發(fā)展中的可能作用機(jī)制，將為GIST的診治提供新的思路。

參考文獻(xiàn)

[1] Ordó?ez J L，Osuna D，Herrero D，et al.Advances in Ewing's sarcoma research：where are we now and what lies ahead？[J].Cancer Res，2009，69（18）：7140-7150.

[2] Jané-Valbuena J，Widlund H R，Perner S，et al.An oncogenic role for ETV1 in melanoma[J].Cancer Res，2010，70（5）：2075-2084.

[3] Baker R，Kent C V，Silbermann R A，et al.Pea3 transcription factors and wnt1-induced mouse mammary neoplasia[J].Plos One，2010，5（1）：e8854.

[4] Vageli D，Ioannou M G，Koukoulis G K.Transcriptional activation of hTERT in breast carcinomas by the Her2-ER81-related pathway[J].Oncol Res，2009，17（9）：413-423.

[5] Oh S，Shin S，Janknecht R.ETV1，4 and 5：an oncogenic subfamily of ETS transcription factors[J].Biochimicaet Biophysica Acta，2012，1826（1）：1-12.

[6] Chi P，Chen Y，Zhang L，et al.ETV1 is a lineage survival factor that cooperates with KIT in gastrointestinal stromal tumours[J].Nature，2010，467（7317）：849-853.

[7] Duffaud F，Blay J Y.Gastrointestinal stromal tumors：biology and treatment[J].Oncology，2003，65（3）：187-197.

[8] Braconi C，Bracci R，Cellerino R.Molecular targets in Gastrointestinal Stromal Tumors （GIST） therapy[J].Curr Cancer Drug Targets，2008，8（5）：359-366.

[9] Kurpios N A，MacNeil L，Shepherd T G，et al.The Pea3 Ets transcription factor regulates differentiation of multipotent progenitor cells during mammary gland development[J].Dev Biol，2009，325（1）：106-121.

[10] De Launoit Y，Baert J L，Chotteau-Lelievre A，et al.The Ets transcription factors of the PEA3 group：transcriptional regulators in metastasis[J].Biochim Biophys Acta，2006，1766（1）：79-87.

[11] Shin S，Kim T D，Jin F，et al.Induction of prostatic intraepithelial neoplasia and modulation of androgen receptor by ETS variant 1/ETS-related protein 81[J].Cancer Res，2009，69（20）：8102-8110.

[12] Dwyer J，Li H，Xu D，et al.Transcriptional regulation of telomerase activity：roles of the the Ets transcription factor family[J].Ann N Y Acad Sci，2007，1114（10）：36-47.

[13] Goueli B S，Janknecht R.Upregulation of the catalytic telomerase subunit by the transcription factor ER81 and oncogenic HER2/Neu，Ras，or Raf[J].Mol Cell Biol，2004，24（1）：25-35.

[14] Oikawa T.ETS transcription factors：possible targets for cancer therapy[J].Cancer Sci，2004，95（8）：626-633.

（收稿日期：2014-03-27） （本文編輯：歐麗）endprint

本研究結(jié)果表明，ETV1在GIST組織中的基因和蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)，在瘤旁正常組織很少表達(dá)，與Chi等[6]研究結(jié)果符合。該結(jié)果提示ETV1在GIST中特異性表達(dá)，可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性。但是否將ETV1的表達(dá)作為評(píng)估腫瘤惡性程度及預(yù)測(cè)發(fā)展仍有待進(jìn)一步研究。深入探索ETV1在GIST發(fā)生發(fā)展中的可能作用機(jī)制，將為GIST的診治提供新的思路。

參考文獻(xiàn)

[1] Ordó?ez J L，Osuna D，Herrero D，et al.Advances in Ewing's sarcoma research：where are we now and what lies ahead？[J].Cancer Res，2009，69（18）：7140-7150.

[2] Jané-Valbuena J，Widlund H R，Perner S，et al.An oncogenic role for ETV1 in melanoma[J].Cancer Res，2010，70（5）：2075-2084.

[3] Baker R，Kent C V，Silbermann R A，et al.Pea3 transcription factors and wnt1-induced mouse mammary neoplasia[J].Plos One，2010，5（1）：e8854.

[4] Vageli D，Ioannou M G，Koukoulis G K.Transcriptional activation of hTERT in breast carcinomas by the Her2-ER81-related pathway[J].Oncol Res，2009，17（9）：413-423.

[5] Oh S，Shin S，Janknecht R.ETV1，4 and 5：an oncogenic subfamily of ETS transcription factors[J].Biochimicaet Biophysica Acta，2012，1826（1）：1-12.

[6] Chi P，Chen Y，Zhang L，et al.ETV1 is a lineage survival factor that cooperates with KIT in gastrointestinal stromal tumours[J].Nature，2010，467（7317）：849-853.

[7] Duffaud F，Blay J Y.Gastrointestinal stromal tumors：biology and treatment[J].Oncology，2003，65（3）：187-197.

[8] Braconi C，Bracci R，Cellerino R.Molecular targets in Gastrointestinal Stromal Tumors （GIST） therapy[J].Curr Cancer Drug Targets，2008，8（5）：359-366.

[9] Kurpios N A，MacNeil L，Shepherd T G，et al.The Pea3 Ets transcription factor regulates differentiation of multipotent progenitor cells during mammary gland development[J].Dev Biol，2009，325（1）：106-121.

[10] De Launoit Y，Baert J L，Chotteau-Lelievre A，et al.The Ets transcription factors of the PEA3 group：transcriptional regulators in metastasis[J].Biochim Biophys Acta，2006，1766（1）：79-87.

[11] Shin S，Kim T D，Jin F，et al.Induction of prostatic intraepithelial neoplasia and modulation of androgen receptor by ETS variant 1/ETS-related protein 81[J].Cancer Res，2009，69（20）：8102-8110.

[12] Dwyer J，Li H，Xu D，et al.Transcriptional regulation of telomerase activity：roles of the the Ets transcription factor family[J].Ann N Y Acad Sci，2007，1114（10）：36-47.

[13] Goueli B S，Janknecht R.Upregulation of the catalytic telomerase subunit by the transcription factor ER81 and oncogenic HER2/Neu，Ras，or Raf[J].Mol Cell Biol，2004，24（1）：25-35.

[14] Oikawa T.ETS transcription factors：possible targets for cancer therapy[J].Cancer Sci，2004，95（8）：626-633.

（收稿日期：2014-03-27） （本文編輯：歐麗）endprint

本研究結(jié)果表明，ETV1在GIST組織中的基因和蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)，在瘤旁正常組織很少表達(dá)，與Chi等[6]研究結(jié)果符合。該結(jié)果提示ETV1在GIST中特異性表達(dá)，可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性。但是否將ETV1的表達(dá)作為評(píng)估腫瘤惡性程度及預(yù)測(cè)發(fā)展仍有待進(jìn)一步研究。深入探索ETV1在GIST發(fā)生發(fā)展中的可能作用機(jī)制，將為GIST的診治提供新的思路。

參考文獻(xiàn)

[1] Ordó?ez J L，Osuna D，Herrero D，et al.Advances in Ewing's sarcoma research：where are we now and what lies ahead？[J].Cancer Res，2009，69（18）：7140-7150.

[2] Jané-Valbuena J，Widlund H R，Perner S，et al.An oncogenic role for ETV1 in melanoma[J].Cancer Res，2010，70（5）：2075-2084.

[3] Baker R，Kent C V，Silbermann R A，et al.Pea3 transcription factors and wnt1-induced mouse mammary neoplasia[J].Plos One，2010，5（1）：e8854.

[4] Vageli D，Ioannou M G，Koukoulis G K.Transcriptional activation of hTERT in breast carcinomas by the Her2-ER81-related pathway[J].Oncol Res，2009，17（9）：413-423.

[5] Oh S，Shin S，Janknecht R.ETV1，4 and 5：an oncogenic subfamily of ETS transcription factors[J].Biochimicaet Biophysica Acta，2012，1826（1）：1-12.

[6] Chi P，Chen Y，Zhang L，et al.ETV1 is a lineage survival factor that cooperates with KIT in gastrointestinal stromal tumours[J].Nature，2010，467（7317）：849-853.

[7] Duffaud F，Blay J Y.Gastrointestinal stromal tumors：biology and treatment[J].Oncology，2003，65（3）：187-197.

[8] Braconi C，Bracci R，Cellerino R.Molecular targets in Gastrointestinal Stromal Tumors （GIST） therapy[J].Curr Cancer Drug Targets，2008，8（5）：359-366.

[9] Kurpios N A，MacNeil L，Shepherd T G，et al.The Pea3 Ets transcription factor regulates differentiation of multipotent progenitor cells during mammary gland development[J].Dev Biol，2009，325（1）：106-121.

[10] De Launoit Y，Baert J L，Chotteau-Lelievre A，et al.The Ets transcription factors of the PEA3 group：transcriptional regulators in metastasis[J].Biochim Biophys Acta，2006，1766（1）：79-87.

[11] Shin S，Kim T D，Jin F，et al.Induction of prostatic intraepithelial neoplasia and modulation of androgen receptor by ETS variant 1/ETS-related protein 81[J].Cancer Res，2009，69（20）：8102-8110.

[12] Dwyer J，Li H，Xu D，et al.Transcriptional regulation of telomerase activity：roles of the the Ets transcription factor family[J].Ann N Y Acad Sci，2007，1114（10）：36-47.

[13] Goueli B S，Janknecht R.Upregulation of the catalytic telomerase subunit by the transcription factor ER81 and oncogenic HER2/Neu，Ras，or Raf[J].Mol Cell Biol，2004，24（1）：25-35.

[14] Oikawa T.ETS transcription factors：possible targets for cancer therapy[J].Cancer Sci，2004，95（8）：626-633.

（收稿日期：2014-03-27） （本文編輯：歐麗）endprint