張毅強(qiáng)，師帥帥，郭改娥，蘇嬌，汪軍梅，李惠芳

（1.長治醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，山西 長治 046000；2.長治醫(yī)學(xué)院附屬和濟(jì)醫(yī)院，腎內(nèi)科，山西 長治 046000）

前列腺源性ETS因子對HCT116細(xì)胞增殖與凋亡的影響

張毅強(qiáng)1，師帥帥2，郭改娥1，蘇嬌1，汪軍梅1，李惠芳1

（1.長治醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，山西 長治 046000；2.長治醫(yī)學(xué)院附屬和濟(jì)醫(yī)院，腎內(nèi)科，山西 長治 046000）

目的探討前列腺源性ETS因子（prostate-derived Ets factor，PDEF）對HCT116細(xì)胞增殖與凋亡的影響。方法體外培養(yǎng)HCT116細(xì)胞，分成空白對照組，空質(zhì)粒組和重組表達(dá)質(zhì)粒組，空質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染不含PDEF的空載體，重組表達(dá)質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染PDEF重組表達(dá)質(zhì)粒。熒光顯微鏡下觀察PDEF重組質(zhì)粒表達(dá)情況；RT-PCR、Western blot檢測3組細(xì)胞PDEFmRNA和蛋白的表達(dá)情況；CCK8法檢測細(xì)胞增殖情況；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果熒光顯微鏡下空質(zhì)粒組和重組表達(dá)質(zhì)粒組HCT116細(xì)胞均可觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)，表明質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞；RT-PCR結(jié)果顯示，與空質(zhì)粒組相比，重組質(zhì)粒組PDEF基因表達(dá)增高263倍；Western blot結(jié)果可見重組質(zhì)粒組有PDEF蛋白的表達(dá)，而空質(zhì)粒組和對照組沒有；CCK8法檢測發(fā)現(xiàn)PDEF基因的表達(dá)能夠明顯抑制HCT116細(xì)胞的增殖（P＜0.05）；流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示重組質(zhì)粒組細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組和空質(zhì)粒組（P＜0.05）。結(jié)論在HCT116細(xì)胞中表達(dá)前列腺上皮源性ETS轉(zhuǎn)錄因子，可以抑制細(xì)胞的增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

前列腺源性ETS因子；增殖；凋亡

1 材料與方法

1.1 材料 HCT116細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，RPMI1640培養(yǎng)基購自HyClone公司，胎牛血清購自杭州四季青生物有限公司。TRIzol及 Lipofectamine 2000脂質(zhì)體購自Invitrogen公司。E.coliDH5α菌為本室自己保存。GV230（PDEF真核表達(dá)質(zhì)粒）購自上海吉凱基因有限公司，質(zhì)粒小量提取試劑盒購自O(shè)mega公司，CCK8購自上海Dojindo公司，AnnexinⅤ-PE標(biāo)記細(xì)胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司。鼠抗人PDEF單克隆抗體購自Abcam公司，鼠抗人β-tublin多克隆抗體及HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購自Santa Cruz公司。ECL低背景化學(xué)發(fā)光試劑盒購自康為世紀(jì)公司。

1.2 方法

1.2.1 倒置熒光顯微鏡觀察重組質(zhì)粒在HCT116細(xì)胞中的表達(dá)：用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HCT116細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前一天，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)細(xì)胞使達(dá)到70～80%融合。實(shí)驗(yàn)設(shè)3組，分別為空白對照組、空質(zhì)粒組和重組質(zhì)粒組，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后于倒置顯微鏡下觀察目的蛋白的表達(dá)。

1.2.2 RT-PCR檢測HCT116細(xì)胞PDEF基因mRNA表達(dá)：HCT116細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞達(dá)到70～80%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染 48 h后，用 TRIzol試劑提取細(xì)胞總 RNA，測定OD260／OD280比值，使在1.8～2.0之間。依據(jù)Takara公司提供的試劑說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系10μL，5×PrimeScript Buffer 2 μL，總 RNA 500ng，逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，在 AB real-time PCR System中進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR分析，GAPDH作為內(nèi)參，每組重復(fù)3次。PDEF引 物 F： 5′-TTACAAGAAGGGCATCATCC-3′， R： 5′-GAAGGTCAGAG CAGCAGAGC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為 188bp，GAPDH引物 F： 5′-TCCTCTGACTTCAACAGCGACA-3′， R： 5′-TTCCTCTTGTGCTCTTG CTGG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為 202 bp，引物均由上海生物工程有限公司合成。PCR循環(huán)條件為：95℃退火30 s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

1.2.3 Western blot檢測PDEF蛋白表達(dá)：各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，分別提取細(xì)胞總蛋白。操作方法如下：吸棄培養(yǎng)液，用1×PBS洗滌3次。加入RIPA裂解液，冰上裂解5 min。用細(xì)胞刮子將細(xì)胞碎片和裂解液移至 EP管中，4℃，12 000 g，離心20min，上清即為提取的總蛋白。將上清液小心轉(zhuǎn)移至新EP管中，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度，定量后分別加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水煮5min。上樣進(jìn)行聚丙烯凝膠電泳，半干電轉(zhuǎn)將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜（0.22μm）上，用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉1.5 h，一抗（小鼠抗人PDEF，稀釋度1∶1 000）4℃孵育過夜，HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG的二抗（1∶1 000）二抗孵育2 h，TBST洗膜后，ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色。

1.2.4 CCK8測定HCT116細(xì)胞增殖能力：按1.2.1中分組，轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，每組以2×103個(gè)／孔（100μL／孔）的濃度將處于對數(shù)期的細(xì)胞接種到96孔板，每孔設(shè)3個(gè)對照，48 h后按照CCK-8試劑盒說明書操作，每孔加10μLCCK8，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用Thermo酶標(biāo)儀在450 nm波長處，測定各孔吸光度值。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：按1.2.1中分組，轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后用PBS清洗細(xì)胞2次，0.25%胰酶消化細(xì)胞，按Annexin V-PE試劑盒說明書操作標(biāo)記細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，每管重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以“±s”表示，服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，組間兩兩比較用Student's t檢驗(yàn)；多組間比較，符合方差齊的，用方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒在HCT116細(xì)胞中的表達(dá)情況 倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞綠色熒光的表達(dá)情況，重組質(zhì)粒組和空質(zhì)粒組均可見綠色熒光，而空白對照組未見綠色熒光，說明重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染入HCT116細(xì)胞（見圖1）。

圖1 熒光顯微鏡觀察HCT-116細(xì)胞轉(zhuǎn)染圖（×200）Fig.1 Transfected HCT-116 cells under fluorescencemicroscopy（×200）

2.2 RT-PCR檢測HCT116細(xì)胞中PDEF基因mRNA的表達(dá) 將上述3組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后分別提取總RNA，表達(dá)情況用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測，以β-tublin作為內(nèi)參。經(jīng)2-ΔΔCT分析可知重組質(zhì)粒組與空質(zhì)粒組相比，PDEF基因表達(dá)增加263倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而空質(zhì)粒組和空白對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染入HCT116細(xì)胞，并能在其中表達(dá)（見圖2）。

圖2 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后HCT116細(xì)胞中的PDEFFig.2 Expression of PDEF in HCT116 cell detected by Real-time quantitative PCR

2.3 Western blot檢測PDEF蛋白的表達(dá) 將轉(zhuǎn)染48 h后的3組細(xì)胞分別提取其總蛋白進(jìn)行Western blot檢測。結(jié)果顯示：重組質(zhì)粒組在37 KDa左右有目的條帶出現(xiàn)，而空質(zhì)粒組和空白對照組在對應(yīng)位置無條帶出現(xiàn)（見圖3）。

圖3 Western blot檢測PDEF蛋白在各組細(xì)胞中的表達(dá)Fig.3 PDEF protein expression by Western blot in each group

2.4 CCK8檢測細(xì)胞增殖情況 與空質(zhì)粒組和空白對照組相比，重組質(zhì)粒組HCT116細(xì)胞的增殖明顯受到抑制（P＜0.05）；而空質(zhì)粒組與空白組對比細(xì)胞增殖情況沒有明顯差異。說明轉(zhuǎn)染PDEF基因能抑制HCT116細(xì)胞的增殖（見圖4）。

圖4 各組細(xì)胞的吸光度值*P＜0.05，與空質(zhì)粒組相比，ΔP＜0.05，與空白對照組相比Fig.4 The absorbance value of cells in each group*P＜0.05，compared with empty plasmid group；ΔP＜0.05，compared with blank control group

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒組細(xì)胞凋亡率為（31.13±0.93），顯著高于空質(zhì)粒組的（25.16±0.12）和空白對照組的（24.78±0.17），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）?？召|(zhì)粒組和空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖5）。

圖5 轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒對HCT116細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 Effects on HCT116 cell apoptosis after transfected with different plasmids

3 討論

結(jié)直腸癌（colorectal cancer）是常見的惡性腫瘤，每年有超過100萬人診斷為結(jié)直腸癌，占全球惡性腫瘤的9.4%［14］，大約四分之一的患者在發(fā)現(xiàn)腫瘤時(shí)已經(jīng)伴有淋巴結(jié)和組織的轉(zhuǎn)移，目前手術(shù)仍是結(jié)直腸癌治療的主要手段。隨著技術(shù)的進(jìn)步，基因治療逐漸成為了腫瘤的一種新的治療方式，與術(shù)后的放化療相比，其特異性相對強(qiáng)，不良反應(yīng)小，因此也為腫瘤患者的治療帶來了新的希望。

PDEF是ETS家族成員，已有研究表明，其與一些腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在一定的相關(guān)性［15-16］，這提示PDEF可能成為結(jié)直腸癌的一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)，雖然其確切的機(jī)制目前并不是很清楚。作為一種轉(zhuǎn)錄因子，PDEF可調(diào)控與其結(jié)合的靶基因［17］，其表達(dá)失調(diào)會導(dǎo)致某些靶基因的異常調(diào)節(jié)，從而影響與細(xì)胞生長分化相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。

本研究通過在HCT116細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染PDEF真核表達(dá)質(zhì)粒，探討了轉(zhuǎn)染前后PDEFmRNA和蛋白水平的改變。轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后，HCT116細(xì)胞比空質(zhì)粒組PDEF表達(dá)水平高，而蛋白水平在對照組和空質(zhì)粒組均未能檢測到PDEF的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染后的重組質(zhì)粒組檢測到PDEF的表達(dá)。進(jìn)一步的細(xì)胞生物學(xué)行為研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后，與對照組相比細(xì)胞的增殖被抑制，凋亡率增高。PDEF對結(jié)直腸癌作用的機(jī)制有待進(jìn)一步的研究，下一步主要研究其與大腸癌發(fā)病密切相關(guān)的幾個(gè)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系，如 WNT信號通路［18］、TGF-β通路、PI3K通路、RTK-RAS［19］信號通路，是否通過與通路上的一些基因的相互作用，而影響癌基因或抑癌基因的表達(dá)，具體的作用機(jī)制也是下一步研究的重點(diǎn)。

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（編校：吳茜）

Effect of PDEF on HCT116 cell proliferation and apoptosis

ZHANG Yi-qiang1，SHIShuai-shuai2，GUO Gai-e1，SU Jiao1，WANG Jun-mei1，LIHui-fang

（1.Department of Biochemistry，ChangzhiMedical College，Changzhi046000，China；2.Department of Nephrology，Changzhi Medical College Affiliated Heji Hospital，Changzhi046000，China）

ObjectiveTo investigate the effect of prostate-derived Ets factor （PDEF） on HCT116 cell proliferation and apoptosis.MethodsHCT116 cell were cultured in vitro and divided into blank control group，empty plasmid group and the recombinant plasmid group.Empty plasmid group were transfected with empty vector without PDEF.Recombinant expression plasmid group were transfected with recombinant plasmid PDEF.The expression of PDEF recombinant plasmid were observed under a fluorescencemicroscope，the expression of PDEFmRNA and protein in three groupswere detected by RT-PCR and Western blot.HCT116 cell proliferation were detected with CCK8 assay，and HCT116 cell apoptosiswere detected by flow cytometry.ResultsThe expression of green fluorescent protein were observed in empty plasmid group and the recombinant plasmid group under a fluorescence microscope，indicating that the plasmid has been successfully transfected into HCT116 cells.RT-PCR results showed that compared with empty plasmid group，the expression of PDEF gene in recombinant plasmid group was increased 263 folds.PDEF protein expression can be detected in recombinant plasmid group，empty plasmid group and control group did not express.CCK8 results revealed that the proliferation of HCT116 cellwere inhibited by PDEF（P＜0.05）.Flow cytometry results showed that cellapoptosis rate in recombinant plasmid group was significant higher than control group and empty plasmid group（P＜0.05）.ConclusionThe expression of PDEF inhibits the proliferation of human colorectal cancer HCT-116 cell and induces apoptosis.

PDEF；proliferation；apoptosis

R73.36

A

1005－1678（2014）05－0026－04

前列腺源性轉(zhuǎn)錄因子（prostate-derived Ets factor，PDEF）是一個(gè)ETS轉(zhuǎn)錄因子家族成員［1］，位于6p21.3，全長1.86kb，其表達(dá)于正常前列腺上皮中［2］，在氣道、乳腺、胃、小腸和大腸的上皮細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)PDEF的表達(dá)［3-5］。ETS家族轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)失調(diào)，在一些腫瘤的形成過程中起到了關(guān)鍵性的作用［6-7］。PDEF作為ETS家族轉(zhuǎn)錄因子的一員其作用近年來也受到廣泛重視。已有報(bào)道表明PDEF的表達(dá)降低與乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌的侵襲與進(jìn)展有關(guān)［8-10］，但是PDEF在腫瘤形成中的作用仍然是目前爭論的話題。目前發(fā)現(xiàn)在腸組織，PDEF的表達(dá)可以促進(jìn)分泌性祖細(xì)胞向杯狀細(xì)胞分化［11-13］，因此推斷結(jié)直腸癌的發(fā)生可能與PDEF的調(diào)控有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過轉(zhuǎn)染 PDEF重組質(zhì)粒進(jìn)入HCT116細(xì)胞，旨在觀察PDEF對HCT116細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響，為進(jìn)一步研究結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

山西省自然科學(xué)基金（20111019）

張毅強(qiáng)，男，漢，博士在讀，講師，研究方向：腫瘤分子生物學(xué)，E-mail：zhangyiqiangty＠163.com。