趙 俊 李 昕 孫玉華

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 開封 475000)

近年來，隨著我國老齡化趨勢的加重，老年癡呆的患者數(shù)量呈逐年增加的趨勢。而血管性癡呆(VD)主要由腦血管性病變引起，導(dǎo)致患者認(rèn)知、學(xué)習(xí)和記憶障礙。研究表明，早期干預(yù)及合理治療，能夠延緩病情的發(fā)展。本實驗旨在觀察丁苯酞作用于VD大鼠后腦內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)變化的影響, 探討丁苯酞對 VD 的作用機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物及主要試劑 14～15月齡的健康 SD 大鼠 60 只, 體重550～650 g。由河南省鄭州大學(xué)實驗動物中心提供。丁苯酞:批號: 050106;兔抗鼠BDNF多克隆抗體、SP 免疫組化試劑盒、BDNF ELISA 檢測試劑盒購自博士德公司，NAB 顯色試劑盒購自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.2動物模型、動物分組與給藥

1.2.1動物模型的建立: 根據(jù) Olsso n 方法〔1〕結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈。假手術(shù)組分離但不結(jié)扎頸總動脈。

1.2.2動物分組與給藥方法 將造模成功的 VD 大鼠隨機分為模型組(MDG)、丁苯酞組(DBT)、假手術(shù)組(SOG)，每組20只。DBT組造模后第 61天開始治療,每灌服丁苯酞 12 mg/100 g; MDG 和 SOG 以等量消毒花生油灌胃;各組均給藥1次/d, 連續(xù)給藥 30 d。

1.3癡呆標(biāo)準(zhǔn) 以SOG組大鼠逃避潛伏期的平均值作為參考,計算結(jié)扎大鼠逃避潛伏期的平均值與參考值之差占該鼠逃避潛伏期的比值,若該值>20%為癡呆鼠。

1.4認(rèn)知功能測試及病理學(xué)檢測

1.4.1大鼠認(rèn)知能力測試 采用 Y型電迷宮法于模型制作 60 d后再三等分 Y型電迷宮內(nèi)進行大鼠學(xué)習(xí)能力測試。先將大鼠放入迷宮內(nèi)適應(yīng) 5 min, 使其對三臂均探索進入,然后從起步區(qū)臂出發(fā), 開始以隨機次序變換測試。設(shè)定電壓 40 V,延遲時間 5 s。電擊后大鼠直接逃避至安全區(qū)為正確反應(yīng), 否則為錯誤反應(yīng)。每測1次休息 30 s ,測 10次休息 5 min。大鼠學(xué)習(xí)成績以連續(xù) 10次測試中有 9次 (9/10)正確反應(yīng)時所需的電擊次數(shù)(嘗試次數(shù))表示。每次測試均在安靜和光線稍暗的條件下進行。6 h后進行記憶能力測試, 對于上述達到 9 /10標(biāo)準(zhǔn)的大鼠再次測試 10次,記錄其中正確反應(yīng)的次數(shù)。

1.4.2電鏡標(biāo)本的制備 大鼠斷頭處死后, 參照大鼠腦圖譜,迅速切取右側(cè)海馬區(qū)組織塊, 迅速放入預(yù)冷 4e 的 4% 的戊二醛中固定,常規(guī)脫水、 Epo n812 環(huán)氧樹脂包埋, LKB超薄切片,醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色,日立 H- 7500 型透射電鏡觀察。

1.4.3免疫組化染色 采用SP法及定量分析計數(shù)方法。在海馬CA1區(qū),分別選擇 3 個相鄰視野, 在 400 倍光鏡下隨機查 100 個神經(jīng)元計數(shù)陽性細胞數(shù),結(jié)果取 3 個視野的平均值。

1.5BDNF 含量測定 90 d后快速處死動物后,取左側(cè)大腦半球,勻漿, 離心后取上清,采用 BDNF 的 ELISA 試劑盒,按說明書逐步操作,最后在酶標(biāo)儀 450 nm 處讀出 A 值, 依照標(biāo)準(zhǔn)含量與 A值建立一元回歸方程以及標(biāo)準(zhǔn)曲線, 取在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)的測量值作方差分析。

2 結(jié) 果

2.1病理學(xué)電鏡結(jié)果 SOG組未見明顯病理變化;MDG可見神經(jīng)細胞高度水腫,皮質(zhì)下和海馬區(qū)有結(jié)構(gòu)較松散的軟化灶,胞體縮小,胞核固縮,胞漿致密,海馬CA1區(qū)細胞數(shù)減少, 胞間距離增大; DBT組皮質(zhì)偶見小的軟化灶,細胞數(shù)和形態(tài)接近正常對照組。見圖1。

2.2各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力測試 見表1。

2.3各組海馬內(nèi)BDNF免疫反應(yīng)陽性細胞數(shù) MDG組、DBT組免疫反應(yīng)陽性細胞數(shù)(77.875±2.031，92.750±4.713)顯著高于SOG組(64.250±3.772)(P<0.05)。

2.4各組動物大腦內(nèi) BDNF的含量 MDG組、DBT組大鼠腦中BDNF含量〔(28.69±2.484)ng/g,(37.174±3.878)ng/g〕顯著高于SOG組〔(18.875±3.903)ng/g〕(P<0.05)。

MDG組

DBT組

SOG組

組別嘗試次數(shù)10次正確數(shù)SOG組44.1 ± 2.28.75 ± 1.06MDG組79.9 ± 2.11)5.12 ± 1.131)DBT組55.7 ± 2.61)2)7.51 ± 1.071)2)

3 討 論

隨著我國老齡化趨勢的加重，VD的發(fā)病率也逐年提高；缺血性損害已成為公認(rèn)的造成VD的主要病因。丁苯酞作為一種線粒體保護劑，其左旋體存在于芹菜籽中〔2〕。其主要作用是維護線粒體的結(jié)構(gòu)和功能,從而達到改善缺血區(qū)微循環(huán)的目的〔3，4〕。有動物實驗表明〔5〕,在缺血性腦卒中治療中丁苯酞具有很好的作用。近年來，一類種類較多的特殊蛋白質(zhì)分子——神經(jīng)營養(yǎng)因子，引起了學(xué)者的關(guān)注。而BDNF作為其中的一種，對腦缺血有保護作用。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)丁苯酞能夠明顯提高缺血后大鼠的記憶和學(xué)習(xí)能力,并逐步改善認(rèn)知功能。作為大腦邊緣系統(tǒng)重要組成部分的海馬在學(xué)習(xí)和記憶等一系列高級神經(jīng)活動中起著關(guān)鍵的作用,因此海馬結(jié)構(gòu)的損害可能是引發(fā)VD的重點之一。本實驗也表明丁苯酞確實能減少海馬神經(jīng)元在缺血狀態(tài)下的壞死程度,從而減輕腦組織不可逆的損害,與近年來國內(nèi)外專家的研究結(jié)果相一致〔6〕。

神經(jīng)營養(yǎng)因子是一類特異性的蛋白質(zhì)。BDNF是重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員，隨著進一步的研究, 人們發(fā)現(xiàn)BDNF具有明確的促進神經(jīng)細胞生長、分化和存活作用;有研究表明〔7〕，外源性BDNF的注入，可造成腦梗死體積縮小,同側(cè)大腦新皮質(zhì)神經(jīng)元細胞核中廣泛分布BDNF樣免疫反應(yīng)產(chǎn)物,說明BDNF可以對抗缺血性腦病。

綜上，丁苯酞通過內(nèi)源性BDNF的表達實現(xiàn)對神經(jīng)元的保護作用, 但是關(guān)于丁苯酞如何啟動了內(nèi)源性BDNF表達，機制尚不十分清楚，有待今后進一步研究闡明。

4 參考文獻

1Olsson Y, Brun A, Engiuund E.Fundamental pathological in vascular dementia 〔 J 〕1 Acta Neurol Suppl, 1996；168(1):31-8.

2崔麗英, 李舜偉, 呂傳真,等.恩必普軟膠囊治療中度急性缺血性卒中的多中心開放臨床研究〔J〕.中國腦血管病雜志,2005;2(3):112 -5.

3熊 杰,馮亦璞.丁基苯酞對局灶性腦缺血過程中線粒體損傷的保護作用 〔J〕.藥學(xué)學(xué)報,2000;35(6):408-12.

4董高翔, 馮亦璞.丁基苯酞對局部腦缺血再灌注大鼠腦線粒體ATPase抗氧化酶活性和脂質(zhì)過氧化的影響〔J〕.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報,2002;24(1):93-7.

5Fiorella D, Heiserman J,Prenger E,etal.Assessment of the reprodu cibility of postprocessing dynamic CT perfusion data〔J〕.AMJN, 2004;25(1):97-107

6沈瑞樂, 王興萍, 滕軍放, 等.丁基苯酞對慢性腦缺血老齡大鼠海馬膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶 mRNA表達的影響〔J〕.鄭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2008;43(2):306-8.

7Hall J,Thomas KL,Everitt BJ.Rapid and selective induction of BDNF expression in the hippocampus during contextual learning〔J〕.Nat Neurosci, 2000;3(6):533-5.