盧彥春，張 蕾，穆長征，李偉偉，金 輝

(1遼寧醫(yī)學院生物化學教研室，遼寧錦州 121000;2遼寧醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院)

研究表明，多種細胞因子及信號通路共同參與神經(jīng)分化的調(diào)控機制，其中卵泡抑素(FS)能夠誘導神經(jīng)分化，并拮抗激活素(Activin)的生物活性進一步抑制胞內(nèi)的Smad3的信號激活［1］。有學者認為，F(xiàn)S作為Activin特異結(jié)合蛋白，還可與TGF-β家族的其他成員結(jié)合，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)、myostatin等，并抑制BMP信號而達到神經(jīng)誘導作用的。而最新研究表明，F(xiàn)S沒有阻止BMP信號，其功能主要是作為 Activin抑制劑，而不是 BMP配體［2］。2010年4月～2012年3月，我們通過觀察鼠神經(jīng)發(fā)育不同階段和部位FS、Activin A與BMP-4基因的表達變化及定位情況，以探討神經(jīng)細胞誘導和分化的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 取同期受孕SD大鼠30只，由遼寧醫(yī)學院科學實驗動物中心提供。將30只大鼠按照胎鼠發(fā)育時間分為胚胎8.5 d(E8.5組)、13 d(E13組)、18 d(E18組)及出生后3 d(P3組)、7 d(P7組)、30 d(P30組)各5只。

1.2 FS、Activin A、BMP-4 表達檢測 E8.5 組、E13組、E18組中每只孕鼠取5只胎鼠，斷頭取腦，經(jīng)40 g/L(4%)多聚甲醛固定;P3組、P7組、P30組各取5只幼鼠經(jīng)腹腔麻醉，打開胸腔，用300 mL(0.1 mol/L)PBS(pH7.4)經(jīng)左心室灌注沖洗，再用40 g/L(4%)多聚甲醛磷酸鹽緩沖液300 mL緩慢灌注固定。應用腦立體定位儀分別切取包含皮質(zhì)、紋狀體、海馬、嗅球組織的腦片，石蠟包埋，連續(xù)進行冠狀切片(厚度為5 μm)，每4張取1張，行免疫組化染色。觀察 FS、Activin A、BMP-4 在皮質(zhì)、紋狀體、海馬、嗅球處表達。免疫組化染色操作步驟按SABC免疫組化染色試劑盒操作說明進行。

1.3 統(tǒng)計學方法 所得數(shù)據(jù)輸入計算機，用SPSS for Windows 10.0版本軟件進行t檢驗和方差分析，結(jié)果以±s表示。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 皮質(zhì) 各組皮質(zhì)陽性細胞分布均勻，F(xiàn)S與Activin A在E8.5組陽性細胞數(shù)最多，在E13組皮質(zhì)的錐體細胞層，細胞著色較深，提示此層細胞FS(圖1)與Activin A(圖2)含量較多，P7組與P30組陽性細胞較少且著色最弱。BMP-4在E8.5～P7組陽性細胞較少，在P30組陽性細胞顯著增多，可見胞質(zhì)染色較強的細胞，主要分布于顆粒層和錐體細胞層(圖3)。

2.2 紋狀體 FS與Activin A在E8.5組陽性細胞數(shù)最多，E13組與E18組陽性細胞數(shù)減少且著色較強，可見胞質(zhì)染色較強的細胞，主要分布于顆粒層(FS見圖4、Activin A見圖5)，P3組陽性細胞數(shù)低于E18組，P7組和P30組陽性細胞較少且著色最弱。BMP-4在E8.5組到P7組陽性細胞較少，著色相對較弱，在P30組陽性細胞顯著增高，細胞著色深，主要分布于顆粒層(圖6)。

2.3 海馬 FS與Activin A在E8.5組陽性細胞數(shù)最多，E13組明顯少于E18組，齒狀回陽性細胞體積較小，數(shù)目較多，E8.5組到P7組各亞區(qū)陽性細胞數(shù)都較多，細胞著色深，主要分布在錐體細胞層、顆粒層(FS見圖7、Activin A見圖8)，P30組陽性細胞數(shù)進一步減少。BMP-4在E8.5組到P7組陽性細胞數(shù)極少且著色極弱，P30組陽性細胞著色較強，細胞著色深，集中在錐體細胞層、顆粒層(圖9)。

2.4 嗅球 FS和Activin A在E8.5組陽性細胞最多。E13組陽性細胞數(shù)略減少，E18組與P3組陽性細胞數(shù)略少于E13組，分布于各層，胞質(zhì)呈深棕黃色，核空泡狀，僧帽細胞可見陽性突起(FS見圖10、Activin A見圖11)，P7組到 P30組進一步減少。BMP-4在E8.5組到P7組陽性細胞數(shù)較少，P30組陽性細胞增多，呈高表達，陽性細胞均在纖維層、僧帽細胞層、顆粒細胞層、髓層較多(圖12)。

圖1 ～12 大鼠大腦皮質(zhì)、紋狀體、海馬、嗅球內(nèi)FS、Activin A與BMP-4免疫組化染色(×400)

3 討論

研究表明，多種細胞因子及信號通路共同參與神經(jīng)分化的調(diào)控機制，成體神經(jīng)發(fā)生亦受缺血、運動等眾多因素的影響［3，4］。其中，F(xiàn)s能夠誘導神經(jīng)分化，并拮抗Activin的生物活性進一步抑制胞內(nèi)的Smad3 的信號激活［1］。Shoji-Kasai等［5］發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元突觸數(shù)量和樹突長度的增加有賴于Activin A。新近的實驗表明，Activin A具有促進原代培養(yǎng)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元神經(jīng)突起生長、抑制神經(jīng)損傷分子NO釋放作用，與神經(jīng)生長因子具有協(xié)同效應［6，7］。根據(jù)配體中的半胱氨酸殘基的分布將TGF-β家族成員區(qū)別為三個亞群，即標準TGF-βs家族、activin/inhibins家族、BMPs家族。Fs與 Activin和Myostatin以高親和力結(jié)合形成基本不可逆的復合物，阻止了受體配體的相互作用，在脊椎動物中幾個作為TGF-β配體亞家族的拮抗劑均與Fs有關。

Bickel等發(fā)現(xiàn)，BMP和Activin配體均為FS作用的靶點。而最新研究表明，F(xiàn)S沒有阻止BMP信號，其功能主要是作為Activin抑制劑，而不是BMP配體，這與Bickel的研究不同。本實驗發(fā)現(xiàn)大鼠大腦皮質(zhì)和紋狀體內(nèi)FS、Activin A在E8.5組陽性細胞數(shù)最多，在E13組與E18組陽性細胞數(shù)減少，P3組陽性細胞數(shù)低于E18組，P7組及P30組細胞著色最弱，而BMP-4基因呈現(xiàn)相反的表達，在E8.5組至P3組著色相對較弱，在P7組開始增強，在P30組陽性細胞顯著增高，提示Fs對 ACT的拮抗特點與Bickel研究結(jié)果相吻合，而Fs與BMP-4的表達呈相反波動趨勢。

眾所周知，神經(jīng)板是最早出現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的結(jié)構(gòu)。參與神經(jīng)板發(fā)生的主要有BMP、Fs、Chorclin和Noggin。Fs是一類分泌性因子，表達于原腸胚期的組織原區(qū)及動物極性外植體中。新近研究發(fā)現(xiàn)，皮層、紋狀體、黑質(zhì)、杏仁核、海馬CAI區(qū)、腦干背側(cè)迷走神經(jīng)復合體、室旁核都有神經(jīng)發(fā)生［8］。本文結(jié)果表明，F(xiàn)S、Activin A在大鼠海馬E8.5組陽性細胞數(shù)最多，E13組明顯低于E8.5組，而BMP-4在此時的著色極弱，提示FS與Activin A蛋白能夠抑制BMP-4的作用，可能對胚胎期和成年期海馬的神經(jīng)發(fā)生調(diào)控起重要作用。近來研究也表明，在出生后20 d至成年階段齒回能產(chǎn)生顆粒細胞，然而和胚胎期及新生期相比，數(shù)量明顯減少［8］。成年大鼠神經(jīng)元前體細胞的遷移流主要有兩條路徑:一條是從SVZ到嗅球的RMS;另一條是位于皮層和胼胝體周圍遷移流［3］。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠嗅球存在兩次嗅感覺神經(jīng)細胞凋亡高峰，分別在胚胎13 d和出生后第5天，隨著嗅球的神經(jīng)發(fā)生，嗅感覺神經(jīng)細胞發(fā)育成熟［9，10］。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)S 和 Activin A 在 E8.5 組嗅球陽性細胞分布于各層，著色最強。E13組陽性細胞數(shù)略減少，而BMP-4在此時陽性細胞數(shù)較少。FS和ACT在E18組至生后P3組呈中等強度表達，陽性細胞數(shù)略少于E13組，二者在P7組進一步減少，P30組降至最低。而BMP-4在P7組陽性細胞數(shù)較少，P30組陽性細胞增多，呈高表達，由此推測FS和Activin A蛋白能夠抑制BMP-4的作用從而阻止嗅上皮的嗅感覺神經(jīng)細胞凋亡的發(fā)生。

總之，F(xiàn)S在神經(jīng)誘導的調(diào)控機制的過程中與Activin A和BMP-4密切相關，作為外胚層的內(nèi)部因素在正常發(fā)育中有重要意義。但神經(jīng)發(fā)育調(diào)控機制復雜，尚需進一步的探索研究。

［1］李偉偉，張蕾，田力.卵泡抑素誘導骨髓間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)元樣細胞［J］.神經(jīng)解剖學雜志，2009，25(6):616-620.

［2］Pentek J，Parker L，Wu A，et al.Follistatin preferentially antagonizes activin rather than BMP signaling in drosophila［J］.Genesis，2009，47(4):261-273.

［3］張濤，王景周.成體腦內(nèi)神經(jīng)發(fā)生和腦缺血對其影響［J］.中華神經(jīng)醫(yī)學雜志，2009，8(2):207-210.

［4］王紅星，徐冬晨，王彤.中樞神經(jīng)再生策略:增強神經(jīng)因子介導的再生環(huán)境“允許”作用［J］.中國康復醫(yī)學雜志，2008，23(4):382-384.

［5］Shoji-Kasai Y，Ageta H，Hasegawa Y，et al.Activin increases the number of synaptic contacts and the length of dendritic spine necks by modulating spinal actin dynamics［J］.Cell Sci，2007，120(Pt 21):3830-3837.

［6］方琳，柳忠輝，劉永茂.激活素促進雞胚神經(jīng)節(jié)神經(jīng)突起生長作用［J］.動物學雜志，2006，41(6):23-28.

［7］方琳，劉永茂，葛敬巖.激活素結(jié)合蛋白阻斷激活素誘導雞胚神經(jīng)節(jié)神經(jīng)突起生長作用及其機制研究［J］.中風與神經(jīng)疾病雜志，2007，24(4):395-397.

［8］Raymond AD，Kucherepa NN，F(xiàn)isher KR，et al.Neurogenesis of oxytocin-containing neurons in the paraventricular nucleus(PVN)of the female pig in 3 reproductive states:puberty gilts and lactating sows［J］.Brain Res，2006，1102(1):44-51.

［9］West MJ，Slomianka L，Gundersen HL.Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivision of the rat hippocampus using the optical fractionator［J］.Anat Rec，1991，231(4):482-497.

［10］Cowan CM，Roskams AJ.Caspase 3 and Caspase 9 mediate developmental apoptosis in the mouse olfactory system［J］.J Comp Neurol，2004，474(1):136-148.