王亞平

(黔東南州人民醫(yī)院骨二科，貴州 凱里 556000)

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是以成骨細胞(OB)活性減弱與破骨細胞(OC)增強為主要病變機制的一種疾病。OB的發(fā)育障礙可能是導致MM發(fā)病的重要原因，骨髓間充質干細胞(MSCs)是骨髓微環(huán)境中的重要組成部分，具有調控與支持造血干細胞的增殖與分化〔2〕，Runx2是MSCs向OB分化過程中的關鍵表達因子〔1〕，但關于Runx2表達對MM患者OB發(fā)育的影響與MM患者MSCs變化及變化程度的研究不多，本文就MM向OB分化的臨床實驗進行觀察分析。

1 材料與方法

1.1材料 磷酸鹽緩沖液(PBS)粉劑，L-DMEM 培養(yǎng)液(10%新生胎牛血清+100 U/ml 青霉素+100 U/L 鏈霉素的低糖 DMEM)，淋巴細胞分離液，0.25% 胰蛋白酶，L-DMEM 條件培養(yǎng)液(地塞米松10-8mol/L +維生素C 0.05 g/L+β-甘油磷酸鈉10-2mol/L)，1%瓊脂糖凝膠，Trizol液，長期培養(yǎng)基(12.5% FCS+12.5%馬血清+2 mmol/L谷氨酰胺+10-6mol/L氫化可的松的培養(yǎng)基)、甲基纖維素，培養(yǎng)體系(30%馬血清+1 g/L BSA+2 mmol/L谷氨酰胺，1×10-4/L β2巰基乙醇+1%甲基纖維素+重組細胞因子)，以上材料分別由GIBCO、Hyclone、Sigma、Gibco等不同公司提供。7900 DNA熒光定量PCR儀由上?；倒咎峁?，流式細胞儀由美國Guava 提供。

1.2檢測方法

1.2.1MSCs分離與培養(yǎng) 隨機選取5例MM患者，入選患者經血液生化檢驗、影像學、病理學與骨髓細胞學等檢查均符合MM的診斷標準〔3〕，男4例，女1例，年齡56～67〔平均(62.58±3.62)〕歲，采集入選患者的骨髓標本作為觀察組；隨機選取4例缺鐵性貧血患者為對照組，其中男2例，女2例，年齡58～67〔平均(63.34±2.97)〕歲。全部患者采集骨髓液5 ml，加肝素防凝固，加PBS粉劑混勻后離心，加等體積的PBS粉劑混勻，將其加入至等體積的淋巴分離液中，2 500 r/min，收集單核細胞層，L-DMEM 培養(yǎng)液洗滌細胞，1 000 r/min離心5 min，調節(jié)密度約106/ml放置培養(yǎng)瓶在5%CO2、37℃培養(yǎng)，按時換液，每日在顯微鏡下觀察細胞的生長狀況。2 w后，使用0.25%胰蛋白酶消化后按照1/3進行傳代。

1.2.2MSCs向OB分化中的增殖與形成能力檢測 當MSCs傳至第3代時，取0.25% 胰蛋白酶2 ml消化，形成單細胞懸液，用L-DMEM 條件培養(yǎng)液使細胞濃度調節(jié)至4.5×104/ml，調整好孔板，上下對照，接種7板，按照流式細胞儀的說明進行檢測操作，測出平均光密度值，記錄數據用以評價MSCs向OB分化中的增殖能力；傳至3代的MSCs重新懸浮液，放置孔板，常規(guī)在5%CO2、37℃的環(huán)境下進行培養(yǎng)，換液。在14、28 d中取蓋玻片進行細胞堿性磷酸酶(ALP)、Von-cosa染色，在顯微鏡下取10個100倍視野進行圖像分析，算出IOD sum / Area sum 值，光鏡下計數鈣結節(jié)數，比較兩組鈣結節(jié)形成的能力。

1.2.3RT-PCR方法 MSCs向OB分化中的Runx2表達,取兩組第3代MSCs，放置孔板，換液，待細胞匯合80%，吸凈培養(yǎng)液，加入L-DMEM 條件培養(yǎng)液進行誘導，對照組在誘導的12、24、36、72 h收集細胞，觀察組在誘導72 h收集細胞106細胞放置于EP管中，逆轉錄細胞及提取細胞總RNA，用7900 DNA熒光定量PCR儀進行擴增，Runx2引物序列：上游：5′-CTGGAGTGATGTGGTTT3′，下游：5′-CCTGTTGTGTTGTTTGG-3′；擴增成功后取1%瓊脂糖凝膠進行40 min的電泳并染色，凝膠成像取片并計算平均光密度值。

1.2.4MSCs造血因子表達 使用Trizol液進行總RNA的提取， 用7900 DNA熒光定量PCR儀對白細胞介素(IL)-3、IL-6、粒細胞集落刺激因子(GM-CSF)、單核細胞集落刺激因子(M-CSF)。干細胞生長因子(SCF)與血小板生長因子(TPO)進行擴增。以還原型輔酶Ⅱ(GAPDH)作為對照組， PCR產物予以電泳并染色，觀察結果。

1.2.5MSCs體外造血的能力檢測 MSCs經紅外線照射后，放置與長期培養(yǎng)基中接種，收集正常體檢者的骨髓單核細胞，預先在培養(yǎng)體系中培養(yǎng)4 h用于消除貼壁細胞，在5%CO2、37℃環(huán)境下進行培養(yǎng)，每7天進行換液，1個月后將全部細胞在甲基纖維素體系中進行接種并檢測其集落形成能力，集落試驗在孔板上進行，106細胞/孔，在5%CO2、37℃中培養(yǎng)，2 w后在顯微鏡下計集落數，50以上細胞作為一個集落。

1.3觀察指標 ①用流式細胞儀進行OB增殖能力的測定，以“平均光密度值”表示，測定IOD sum/Area sum 值，光鏡下計數鈣結節(jié)數用以評價OB的形成能力。②Runx2表達強度應用平均光密度值定量表示；應用電泳圖分析造血因子的表達情況。③比較在長期培養(yǎng)基中培養(yǎng)1個月后的MM患者與正常體檢者的細胞集落形成狀況，評價MM患者體外造血能力。

2 結 果

2.1患者MSCs向OB分化中的增殖與形成能力 流式細胞術檢測OB增殖能力顯示：在L-DMEM 條件培養(yǎng)液的誘導下，兩組患者第3～4天的細胞增殖處于對數生長期，第5天細胞增殖能力下降，并處于平臺期。第7天，觀察組的平均光密度值(1.186±0.641)顯著低于對照組(1.531±0.912)(P<0.05)；觀察組IOD sum/Area sum值(0.198±0.047)與平均鈣結節(jié)數(11.30±6.31)均顯著低于對照組〔(0.347±0.034)、(16.09±5.36)〕(P<0.05)。

2.2MM患者MSCs向OB分化中的Runx2表達 MM患者在MSCs誘導后Runx2表達(0.956±0.076)顯著高于MSCs誘導前(0.614±0.068)(P<0.05)，觀察組患者的平均光密度(0.496±0.158)顯著低于對照組(0.821±0.162)(P<0.05)。

2.3患者MSCs造血因子表達 RT-PCR方法顯示：可檢測IL-6、M-CSF與SCF在MSCs中的表達，未檢測到TPO與GM-CSF的表達。見圖1。

2.4患者MSCs體外造血的能力 在長期培養(yǎng)基中培養(yǎng)1個月后可檢測到細胞集落的形成，MM患者MSCs具有促進紅細胞系集落(CFU-E)、粒細胞系集落(CFU-GM)與粒細胞巨噬細胞系集落(CFU-GEMM)增殖的能力，在MM患者培養(yǎng)體系中各種細胞系集落的產率與正常體檢者培養(yǎng)體系中各種細胞系集落的產量之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 MM患者與正常體檢者細胞系集落的產量之間的比較

圖1 MM患者MSCs造血因子表達

3 討 論

MM是以骨髓內惡性克隆的細胞增殖與免疫球蛋白的產生為特點，好發(fā)于老年的血液惡性疾病〔4〕，主要臨床病理表現為：①骨髓微環(huán)境產生破骨細胞刺激因子(IL-6、IL-3等)刺激OC增多，促進骨髓瘤細胞的增多、浸潤及破壞骨組織，導致MM骨髓微環(huán)境下OB的活性減弱與OC活性增強〔5〕；②OB的分化障礙導致了MM的形成，研究〔6〕表明，MM患者的OB增殖與形成能力顯著降低，OC活性增強與OB活性減弱聯合導致MM的發(fā)病。關于OB發(fā)育障礙的機制尚不清楚，研究〔7〕認為Runx2表達是OB的特異性轉錄因子，是OB分化的標志。目前臨床常使用的化療效果不佳，自體造血干細胞移植與大劑量化療聯合的臨床療效更佳〔8〕，其中異基因造血干細胞移植是可治愈MM的唯一方法，但是移植前治療與化療均會破壞MSCs，從而影響MM患者移植治療的療效與移植后的血液恢復〔9〕。MSCs可支持體內外造血的作用，聯合MSCs的造血干細胞移植可顯著提高MM的治療效果。有研究〔10〕也表明：聯合MSCs的造血干細胞移植可促進造血干細胞的移植與移植后造血功能的恢復。具有應用價值的自體MSCs在來源、患者經濟負擔與排斥方面均顯著優(yōu)于異體基因MSCs；而且自體MSCs具有異體基因MSCs所缺乏的修復損傷骨髓基質細胞的功能〔11〕。因此，研究MM患者OB分化程度、Runx2在OB分化中的影響與自體MSCs是否可以應用于臨床將為MM骨髓造血干細胞的移植提供重要的理論與實踐依據。

本研究結果揭示MM患者OB分化中的增殖與形成能力下降，有研究〔12〕表明，MM骨髓微環(huán)境中Runx2的表達顯著低于正常人，與本研究結果一致，說明了Runx2的低表達有助于MM骨病的形成， MSCs誘導前Runx2呈弱表達而誘導后Runx2呈高表達的機制可能是MSCs具有潛在分化OB的功能與OB前期Runx2表達強，因此，Runx2主要作用于OB形成早期，而Runx2的表達減弱可能導致MM患者MSCs向OB分化中的增殖與形成能力的減弱。MM患者自體的MSCs可檢測到造血因子的表達，IL-6在MM患者與正常MSCs中無差別，推測IL-6可能與MSCs支持體內外造血的作用有關，與靖彧等〔13〕的研究相符。MM患者與正常MSCs體外造血的能力無顯著差別，表明了自體MSCs在MM骨髓造血干細胞的移植中具有臨床應用價值。

綜上，MM患者MSCs向OB分化中的增殖與形成能力減弱，可能與Runx2的表達減弱相關，MM患者與正常MSCs體外造血的能力無顯著差別，預測MM患者自體MSCs聯合骨髓造血干細胞移植在MM的診治中具有臨床應用價值。

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