席守民 萬學東 李三強 楊五彪 胡 澍 魏硯秋

(河南科技大學醫(yī)學院藥理學與醫(yī)學分子生物學重點實驗室，河南 洛陽 471003)

氧自由基對腦神經(jīng)細胞的氧化修飾作用是導致神經(jīng)元損傷的主要途徑之一，在帕金森病和阿爾茨海默病的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的地位〔1〕。H2O2是活性氧族的主要成分之一，可以跨膜擴散進入細胞內，是一種比較常用的細胞氧化應激誘導劑，廣泛用于誘導細胞氧化應激模型。Smith等〔2〕發(fā)現(xiàn)急慢性應激使大鼠海馬等腦區(qū)細胞腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)表達降低和神經(jīng)元受損，提出神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)可塑性受損學說。研究發(fā)現(xiàn)，許多傳統(tǒng)中藥對腦缺血保護作用的機制是通過提高內源性BDNF的產生實現(xiàn)的〔3〕。蝸牛多肽提取物(SPE)對腦神經(jīng)元保護作用的研究未見相關報道，本研究采用H2O2造成人神經(jīng)母細胞瘤細胞株(SH-SY5Y)細胞損傷模型，觀察不同濃度SPE抑制SH-SY5Y細胞氧化損傷的效果，探討SPE對神經(jīng)元細胞保護的作用機制。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑 白玉蝸牛(洛陽綠爾農業(yè)科技有限公司)；小牛血清、DMEM(Gibco BRL公司)；兔抗人單抗BDNF(武漢博士德生物工程有限公司)；SP免疫組化試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司)；DAB顯色試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術有限公司)。

1.2蝸牛多肽提取物的制備 參照文獻〔4〕中的方法，取200 g新鮮蝸牛組織加500 ml預冷冰醋酸溶液(pH3.5)，膠體磨反復勻漿，勻漿液4℃，5 500 r/min離心10 min，取上清，55℃真空旋轉蒸發(fā)濃縮至體積為100 ml；濃縮液凍干，交聯(lián)葡聚糖凝膠G-25分離層析，得到4個峰，分別收集，MTT法體外活性實驗檢測第2峰值活性最強。收集第2峰樣品，濃縮凍干，BCA法測定樣品中蛋白質含量為84.81%，氧化酶法測定樣品中葡萄糖含量僅為0.24%，即為蝸牛多肽提取物，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3細胞培養(yǎng) 人神經(jīng)母細胞瘤細胞株(SH-SY5Y)(中國科學院上海細胞生物學研究所)用含2 mmol/L谷氨酰胺和10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天傳代細胞，當傳代細胞在倒置顯微鏡下觀察均勻貼壁生長時，可用于實驗。

1.4MTT法檢測H2O2對SH-SY5Y細胞的損傷作用 將生長狀態(tài)良好的SH-SY5Y細胞以1×104細胞/孔接種于96孔板，待細胞貼壁，棄去培養(yǎng)液，每孔加含不同濃度0.25～6.0 mmol/L H2O2的培養(yǎng)液200 μl，陰性對照組加不含H2O2的培養(yǎng)液200 μl，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后每孔加入5 g/L MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液，每孔加入200 μl二甲基亞砜(DMSO)，震蕩5 min后酶標儀(ELX800，美國Bio-Tek公司)檢測490 nm處每孔的吸光度(A)值。細胞存活率=給藥組A值/陰性對照組A值×100%。Origin軟件計算半數(shù)抑制濃度IC50。

1.5MTT法測定SPE對H2O2誘導SH-SY5Y細胞損傷的抑制作用 取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞，以1×104細胞/孔接種于96孔板，待細胞貼壁，H2O2組以1.54 mmol/L(IC50值)H2O2作用于SH-SY5Y細胞，SPE組分別以39、78、156、312.5、625及1 250 mg·L-1SPE和1.54 mmol/LH2O2(分別為B、C、D、E、F、G組)作用于SH-SY5Y細胞，正常對照組只有SH-SY5Y細胞，不加任何藥物(A組)。給藥24 h后每孔加5g/L的MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液，每孔加200 μl DMSO，震蕩5 min后酶標儀490 nm處檢測吸光度值(A)。

1.6細胞免疫化學技術檢測細胞BDNF的表達 取對數(shù)生長期SH-SY5Y細胞消化制備細胞懸液，調整細胞濃度為1×104/ml，接種于6孔板內，培養(yǎng)24 h后，將細胞分為4組，H2O2組：加1.54 mmol/L H2O2；正常對照組：正常細胞培養(yǎng)，不加藥物；SPE-L組：加SPE 39 mg/L和1.54 mmol/L H2O2；SPE-H組：加SPE 156 mg/L和1.54 mmol/L H2O2。以上各組平行3孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，爬片用PBS液漂洗2遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS液洗滌后自然風干。檢測方法按免疫組化試劑盒說明進行。

1.7Western 印跡檢測細胞BDNF的表達 取對數(shù)生長期SH-SY5Y細胞，接種于6孔板內，培養(yǎng)24 h后，將細胞分為4組(分組同1.6)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔分別加入120 μl 蛋白裂解液，冰浴下靜置30 min，分別收集，95℃加熱5 min后，取25 μl樣品進行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結束后取出凝膠，于4℃下60 mA電流轉印過夜至硝酸纖維素膜，脫脂奶粉封閉1 h，分別加入1∶1 000稀釋的BDNF單抗4℃過夜，洗膜后用1∶2 000稀釋的二抗孵育2 h，按照Super Signal west pico chemiluminescent substrate 試劑盒(PIERCE公司，美國)說明，加入顯色劑后，X光片于室溫下自顯影20 s，使用凝膠成像分析系統(tǒng)(GDS-800，美國UVP公司)攝像并分析。

2 結 果

2.1H2O2對SH-SY5Y細胞生長率的影響 用0.25～6.0 mmol/L不同濃度的H2O2分別處理SH-SY5Y細胞24 h后，該細胞的存活率呈濃度依賴性降低。Origin軟件計算可知，H2O2對SH-SY5Y細胞IC50值為1.54 mmol/L，見圖1。

2.2MTT法測定SPE抗H2O2誘導SH-SY5Y細胞毒性 加入1.54 mmol/L H2O2(A組)作用24 h后，SH-SY5Y細胞存活率僅為(47.65±3.52)%，而同時加入不同濃度的SPE的治療組的細胞生長力明顯較A組好。B〔(84.42±4.22)%〕和C組〔(92.19±7.86)%〕與A組比較差異有顯著性意義(P<0.05)，D、E、F、G組〔(115.6±6.79)%、(110.18±3.99)%、(108.63±1.64)%、(113.96±0.84)%〕分別與A組比較差異有顯著性意義(P<0.01)，但B組與C組比較及D～G組之間比較均無明顯差異性。提示低劑量39 mg/L和高劑量156 mg/L SPE均可顯著降低H2O2引起SH-SY5Y細胞毒性。

圖1 MTT法檢測不同濃度的H2O2處理后的SH-SY5Y細胞生長率

2.3免疫細胞化學檢測SH-SY5Y細胞BDNF的表達結果 BDNF表達于細胞胞質中，染色陽性信號呈棕黃色。與正常對照組比較，H2O2組SH-SY5Y細胞BDNF的表達明顯減少； SPE-L組和SPE-H組BDNF表達則較H2O2組明顯增強，呈強陽性染色，且陽性細胞數(shù)明顯增加。見圖2。

圖2 免疫組化檢測BDNF組SH-SY5Y細胞中的表達 (×200)

2.4Western 印跡法檢測SH-SY5Y細胞BDNF的表達結果 由圖3可見，H2O2組SH-SY5Y細胞BDNF的表達明顯較正常對照組減少，而SPE-L組和SPE-H組細胞中BDNF表達均較H2O2組明顯升高，呈劑量依賴性，與H2O2組比較差異有顯著性意義(tL=-5.984,PL=0.004;tH=-10.636,PH=0.000)。見圖3。

圖3 4組SH-SY5Y細胞中BDNF蛋白質的表達

3 討 論

氧化應激誘發(fā)的自由基損傷是導致神經(jīng)元凋亡的基本原因之一，因此抗氧化是保護神經(jīng)元的有效途徑。H2O2是氧化應激反應密切相關的活性氧之一，其主要產物具有很強的氧化性并可自由進入細胞，在許多神經(jīng)元細胞培養(yǎng)模型中可引起細胞損傷，且許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病都涉及氧化應激損傷〔5，6〕。細胞內氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡，導致活性氧在細胞中累積是氧化應激的主要特征之一。H2O2氧化應激誘導SH-SY5Y細胞損傷與細胞內活性氧增多、線粒體功能失常等因素有關〔7〕。實驗證明，用1.54 mmol/L H2O2處理SH-SY5Y細胞，可以引起細胞存活率明顯降低。

BDNF基因定位于人類11號染色體1區(qū)3帶，BDNF主要由腦組織合成的一種堿性蛋白質，分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，如海馬、皮質、紋狀體、基底前腦、丘腦、腦干和小腦中。近來發(fā)現(xiàn)周圍神經(jīng)系統(tǒng)也有BDNF的合成〔8〕。BDNF不僅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中對神經(jīng)元的生存、分化、生長和維持神經(jīng)元正常的生理功能起關鍵作用，而且還具有抗傷害性刺激，促使神經(jīng)元損傷后的再生等作用〔9〕。近年來研究表明，BDNF不僅能維持發(fā)育及促進成年神經(jīng)元存活〔10，11〕，還在營救損傷神經(jīng)元〔12，13〕，促進神經(jīng)再生〔14〕，促進突觸重建〔15〕，參與膠質細胞損傷〔16〕，改進神經(jīng)行為學〔17～19〕等方面發(fā)揮著調節(jié)作用。從其功能看，BDNF應該在神經(jīng)損傷修復治療中有良好的應用前景。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2既可引起SH-SY5Y細胞存活率的下降，同時也使細胞內BDNF表達降低，表明二者之間存在著相關性。

在對腦缺血的研究中，許多中藥具有提高內源性BDNF的作用。復方麝香注射液有明顯促進BDNF含量增加的作用，并使其作用時間延長〔20〕。醒腦解毒湯能上調大鼠局灶性腦缺血再灌注模型腦組織中BDNF mRNA表達，改善急性期缺血性中風大鼠腦組織的缺血情況〔21〕。夏天無可通過調節(jié)BDNF的表達發(fā)揮腦神經(jīng)保護作用從而使腦梗死大鼠的腦組織病理形態(tài)改善，對腦梗死模型大鼠起到治療作用〔22〕。電針刺激能改善抑郁癥大鼠的行為學及海馬神經(jīng)元的病理變化,證明CREB-BDNF受體后信號轉導通路是針刺抗抑郁的重要途徑和作用靶點之一〔23〕。蝸牛提取物通過干擾病毒吸附和穿入宿主細胞等機制明顯抑制HBV復制的作用，且無細胞毒性〔24〕。Tsoutsos等〔25〕采用蝸牛提取物用于治療開放性創(chuàng)傷和面部深度燙傷，發(fā)現(xiàn)蝸牛提取物可以促進開放性創(chuàng)傷和深度燙傷的皮膚愈合，提示蝸牛提取物中某些成分可促進組織細胞修復和再生。本研究發(fā)現(xiàn)，無論是低劑量還是高劑量的SPE均具有抗氧化作用，能夠抑制H2O2引起的細胞毒性作用，并且可明顯提高細胞的存活率，顯示出SPE具有保護神經(jīng)細胞的作用，為進一步研究SPE的神經(jīng)保護作用提供了依據(jù)。

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