聞淑娟 安 欣 楊 航 彭柔君 史艷俠

(中山大學(xué)腫瘤防治中心腫瘤內(nèi)科，廣東 廣州 510060)

乳腺癌的發(fā)生是多因素、多階段、進(jìn)行性發(fā)展的過程，涉及多個(gè)癌基因的激活和抑癌基因的失活。著絲粒是與細(xì)胞周期以及細(xì)胞增殖檢查點(diǎn)調(diào)控相關(guān)的重要結(jié)構(gòu)，組成著絲粒的著絲粒蛋白(CENPs) 是發(fā)揮作用的主要元素。CENP-F是人類CENPs中分子量最大的一個(gè)成員，在細(xì)胞有絲分裂中發(fā)揮著重要作用〔1〕。目前國內(nèi)尚無CENP-F在乳腺癌中的表達(dá)及與乳腺癌預(yù)后關(guān)系的相關(guān)研究。本文擬分析CENP-F蛋白在乳腺癌標(biāo)本中的表達(dá)，探討它們與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及預(yù)后評(píng)估的意義。

1 材料與方法

1.1對(duì)象 選取2000年1月至2002年12月在中山大學(xué)腫瘤防治中心行乳腺癌改良根治術(shù)或根治術(shù)的原發(fā)性乳腺癌患者158例，全部為女性，術(shù)前未行化療、放療和內(nèi)分泌治療。另選20例正常乳腺組織作為對(duì)照組。年齡22～73歲(中位年齡45歲)。所有患者均為浸潤性導(dǎo)管癌(2003年WHO腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn))，ECOG評(píng)分≤1；全部乳腺癌病例隨訪73.4 個(gè)月(13.3～160個(gè)月)。所有患者均有完整的臨床資料。

1.2方法

1.2.1免疫組化方法 按照試劑盒說明書二步法步驟執(zhí)行 (Dako Carpinteria，CA)。用已知陽性片作為陽性對(duì)照，用PBS代替一抗作為空白對(duì)照。將石蠟包埋的標(biāo)本按4 μm切片，常規(guī)脫蠟后抗原修復(fù)，然后置入3%H2O2室溫孵育15 min后滴加一抗，置于濕盒中4℃過夜；PBS沖洗后滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔二抗，室溫孵育30 min；PBS沖洗后DAB顯色，洗滌，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片，鏡下觀察。

1.2.2結(jié)果判斷 免疫組化染色結(jié)果由兩位病理科醫(yī)師獨(dú)立閱片得出。CENP-F染色評(píng)分采用染色強(qiáng)度及染色程度兩方面評(píng)估。出現(xiàn)棕黃色或棕色顆粒的細(xì)胞為陽性細(xì)胞，CENP-F陽性部位在細(xì)胞核。染色強(qiáng)度得分0～3分，0分(無染色)，1分(淡黃色顆粒)，2分(棕黃色顆粒)和3分(棕色顆粒)。染色程度得分0分(0%)，1分(1%～10%)，2分(11%～ 25%)，3分(26%～50%)及4分(>50%)，強(qiáng)度和程度得分之和作為最后CENP-F染色評(píng)分(0～7)，最終染色分?jǐn)?shù)<3分為CENP-F陰性表達(dá)，≥3分為CENP-F陽性表達(dá)。

1.2.3隨訪及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 隨訪從治療第一天開始計(jì)算，所有患者均隨訪至2013年6月?？偵鏁r(shí)間 (OS)指從診斷之日起至死亡時(shí)間。隨訪終止未死亡病例按刪失病例處理。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS18.0軟件，各組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)；應(yīng)用Kaplan-Meier法制作生存曲線，使用Log-Rank檢驗(yàn)比較生存差異，分析研究OS的線性趨勢。應(yīng)用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型行多因素分析。

2 結(jié) 果

2.1CENP-F在乳腺癌中的表達(dá) 158例乳腺癌組織中，89例陰性表達(dá)，69例(43.7%)CENP-F陽性表達(dá)，正常乳腺細(xì)胞未見CENP-F表達(dá)或僅見低表達(dá)。見圖1。

圖1 CENP-F在乳腺癌細(xì)胞中的過表達(dá)(DAB)

2.2CENP-F表達(dá)與乳腺癌臨床病理因素的關(guān)系 CENP-F 表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.033)及臨床分期(P=0.027)有關(guān)。與年齡、腫塊大小、激素受體(HR)、人表皮生長因子受體(Her-2)及Ki67表達(dá)等因素?zé)o關(guān)(P>0.05)，見表1。

表1 CENP-F的表達(dá)與乳腺癌組織臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系〔n(%)〕

2.3CENP-F陽性表達(dá)與患者OS呈負(fù)相關(guān) CENP-F陰性表達(dá)組患者5年生存率為96.6% (86/89) ，CENP-F陽性表達(dá)組患者5年生存率為88.4% (61/69) 。CENP-F陰性組10年總生存率(57.3%)明顯高于陽性組(24.6%)(P<0.001)。 CENP-F的表達(dá)與OS有關(guān)，CENP-F陰性表達(dá)患者的OS明顯高于陽性患者〔(130.00±4.15)vs(103.00±9.09)個(gè)月，P=0.004〕(圖2)。應(yīng)用Cox模型對(duì)生存資料行多因素分析，把年齡、腫塊大小、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、CENP-F、HR、HER-2和Ki67表達(dá)納入乳腺癌OS的全變量模型分析，結(jié)果顯示CENP-F陽性表達(dá)(P=0.039)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.045)、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期(P=0.002)、HER-2過表達(dá)(P=0.031)及Ki67≥15%(P=0.021)均為影響乳腺癌OS的獨(dú)立不良預(yù)后因素。而HR的表達(dá)則為乳腺癌OS的有利因素(P=0.015)(見表2)。

圖2 CENP-F陽性表達(dá)與OS的相關(guān)性分析

表2 乳腺癌OS的預(yù)后分析

3 討 論

在細(xì)胞有絲分裂和減數(shù)分裂過程中，著絲粒是保證染色體穩(wěn)定存在，并且正常分裂、分離到子細(xì)胞中的基本結(jié)構(gòu)、功能元件之一。CENP-F 又稱Mitosin/P330d，本質(zhì)是一種核磷蛋白，全長10.3 kb，編碼3 210個(gè)氨基酸，分子量367 kD〔2，3〕。著絲粒位于染色體表面，其上可附著紡錘體微管。CENP-F在有絲分裂中起重要作用，包括著絲粒和著絲點(diǎn)成熟、染色體調(diào)整和分離、分裂后期紡錘體的穩(wěn)定等〔4〕。因此，細(xì)胞周期特異性表達(dá)的CENP-F可以作為增殖的潛在標(biāo)記物。目前國外有文獻(xiàn)報(bào)道40%左右的乳腺癌患者中有CENP-F的擴(kuò)增和過表達(dá)，CENP-F過表達(dá)與腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)相關(guān)，提示該癌基因與乳腺癌進(jìn)展有關(guān)，可能參與細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)〔5〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示CENP-F陽性表達(dá)與病期進(jìn)展相關(guān)。事實(shí)上，CENP-F已被證實(shí)在多種腫瘤中均有擴(kuò)增，且CENP-F的過表達(dá)與腫瘤的增殖有密切關(guān)系，如非霍奇金淋巴瘤、胃腸間質(zhì)瘤、鼻咽癌等〔6～8〕。CENP-F能夠促進(jìn)腫瘤增殖可能與CENP-F的功能有關(guān)。CENP-F法尼基化后，在有絲分裂期與其他蛋白參與著絲粒裝配、微管附著、紡錘體檢測〔9〕。CENP-F異常表達(dá)使著絲點(diǎn)聚集和紡錘體檢查點(diǎn)功能紊亂，從而促進(jìn)染色體不正確分離，造成正常遺傳物質(zhì)丟失，導(dǎo)致遺傳物質(zhì)的丟失，增加腫瘤的增殖活性〔10〕。

本研究顯示CENP-F陽性表達(dá)的乳腺癌患者預(yù)后差，生存期短。CENP-F陽性表達(dá)是腫瘤不良預(yù)后因素的結(jié)論在其他腫瘤中也有報(bào)道。Cao等〔8〕在鼻咽癌的研究結(jié)果顯示，CENP-F過度表達(dá)的鼻咽癌腫瘤惡性程度增強(qiáng)，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移發(fā)生早，預(yù)后差，并與患者的無病生存和總生存期有關(guān)〔7〕。Guardia等〔11〕報(bào)道CENP-F高表達(dá)的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌總生存期明顯低于陰性表達(dá)組，且CENP-F高表達(dá)是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌OS的不良預(yù)后因素之一〔11〕。吳長山等〔12〕研究結(jié)果顯示CENP-F陽性表達(dá)的腦膜瘤患者具有較高的腫瘤復(fù)發(fā)率和較短的無瘤生存時(shí)間。CENP-F表達(dá)與染色體不穩(wěn)定(CIN)有關(guān)，后者在大部分腫瘤分級(jí)和預(yù)后中起著決定性作用〔13〕，這可能是CENP-F陽性表達(dá)是腫瘤不良預(yù)后因素的機(jī)制。但是，CENP-F的生物學(xué)功能與CIN之間的具體機(jī)制尚未闡明，今后仍需進(jìn)一步的深入研究。

綜上所述，CENP-F在乳腺癌中呈擴(kuò)增和過表達(dá)，CENP-F過表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，CENP-F高表達(dá)是乳腺癌的不良預(yù)后因素，可作為指導(dǎo)治療和估計(jì)預(yù)后的參考指標(biāo)，CENP-F檢測可為臨床確診及預(yù)后判斷等提供重要依據(jù)。

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