朱向東 曹燕飛 王 燕 段永強(qiáng)

(甘肅中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)課部，甘肅 蘭州 730000)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是以腹痛腹瀉、黏液膿血便持續(xù)或反復(fù)發(fā)作為主要癥狀的腸道慢性非特異性炎癥。該病發(fā)病原因及機(jī)制尚不明確，復(fù)發(fā)率高，且有癌變傾向，目前尚缺乏滿意的治療方法，已被列為現(xiàn)代難治病之一〔1，2〕，因此，有關(guān)其病因病機(jī)的探討以及治療藥物的研發(fā)已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。筆者臨床上用痛瀉要方加減治療該病，取得了顯著療效。前期藥效學(xué)研究證實(shí)痛瀉要方能有效改善UC黏膜炎癥、促進(jìn)潰瘍的修復(fù)，但作用機(jī)制不清。NF-κB是一種多功能核轉(zhuǎn)錄因子，具有廣泛的生物學(xué)活性，在機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)中起重要作用。已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)〔1〕，NF-κB p65的表達(dá)與UC的發(fā)病密切相關(guān)，但目前對(duì)于NF-κB p65與UC的關(guān)系研究還不夠深入，NF-κB p65在腸道炎癥中的作用機(jī)制還不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討痛瀉要方對(duì)UC大鼠模型結(jié)腸黏膜NF-κB p65蛋白和基因表達(dá)的影響，以期探討痛瀉要方的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物 采用SPF級(jí)Wistar大鼠60只，體質(zhì)量(180±10)g，雌雄各半，由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，SPF級(jí)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXKC(甘)2004-0006；SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)設(shè)施合格證號(hào)：SYXKC(甘)2004-0006-0001561。

1.1.2試劑 2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)：購(gòu)于北京邦定泰克生物技術(shù)有限公司，由美國(guó)sigma公司生產(chǎn)，批號(hào)為〔2008-16-2〕； TRIzol試劑(批號(hào)19919)、瓊脂糖(批號(hào)0000101394)均購(gòu)自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)0000007526)、PCR試劑盒(批號(hào)108030404)均購(gòu)自Promega Corporation。一抗NF-κB p65 (北京博奧森生物工程開(kāi)發(fā)有限公司)；SP免疫組化染色試劑盒(北京博奧森生物工程開(kāi)發(fā)有限公司)；DAB染色試劑盒(北京博奧森生物工程開(kāi)發(fā)有限公司)。

1.1.3儀器與設(shè)備 美國(guó)BIO-RAD S1000TM型PCR儀；美國(guó)BIO-RAD 凝膠成像儀、電泳槽、電泳儀等；美國(guó)Bio-RAd核酸定量分析儀；德國(guó)3-16PK型通用臺(tái)式高速離心機(jī)、海爾DM-86L626型立式超低溫冰箱等；成都太盟BI-2000圖像分析系統(tǒng)之免疫組化分析系統(tǒng)。

1.1.4受試藥物 痛瀉要方由4味藥物組成。按原方3∶2∶1∶1的比例取陳皮、白術(shù)、白芍、防風(fēng)，用8倍量70%的乙醇每次回流2 h，提取3次，得醇提取液和醇提取藥渣。合并3次醇提取液，濾過(guò)，濾液減壓回收乙醇后得醇提取濃縮液，干燥得干膏，干膏粉碎成細(xì)粉，加入揮發(fā)油。實(shí)驗(yàn)用不含賦形劑的浸膏，冰箱保存?zhèn)溆?。柳氮磺胺嘧?SASP):上海信誼嘉華藥業(yè)有限公司，批號(hào)：H31020557。

1.2方法

1.2.1造模方法 采用TNBS/乙醇溶液灌腸法制作UC大鼠模型：將Wistar大鼠60只，禁食(不禁水)24 h，用10%水合氯醛腹腔麻醉(0.3 ml/100 g)后，一次性將TNBS/乙醇液(100 mg/kg TNBS+50%的乙醇0.25 ml)溶液用橡膠輸液管輕緩注入大鼠距肛門約7～8 cm深的腸腔內(nèi)，留置數(shù)分鐘。然后用針頭抽取一定量的空氣，同樣的方法注入大鼠腸腔，防止溶液外漏，讓動(dòng)物保持平躺狀態(tài)，自然清醒；空白組10只大鼠也采用同樣方法用等量的生理鹽水灌腸。

1.2.2分組與給藥 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為6組：空白組、模型組和痛瀉要方低、中、高劑量組及SASP組，每組10只。除空白組外均以100 g/kg TNBS加50%乙醇0.25 ml混合試劑灌腸。痛瀉要方低、中、高劑量組分別按生藥11、22、44 g/kg劑量灌胃(按照臨床成人用量的5、10、20倍折算)，SASP組按0.3 g/kg劑量灌胃，灌胃體積均為10 ml/kg，空白組、模型組灌服等體積生理鹽水。各組于造模后第2天開(kāi)始灌胃，1次/d，連續(xù)21 d。3 w后處死，取標(biāo)本。

1.2.3取材 大鼠禁食24 h(不禁水)后，脫頸椎法處死大鼠，取血后迅速剖腹，取出距肛門以上8 cm處結(jié)腸段，沿腸系膜緣剪開(kāi)腸腔，用冷PBS緩沖液沖洗腸內(nèi)容物，肉眼觀察各組大鼠腸組織大體形態(tài)情況記錄并進(jìn)行評(píng)分。取病變最明顯處0.5 cm左右結(jié)腸組織，迅速移至液氮中保存，用于基因表達(dá)檢測(cè)。大體形態(tài)損傷評(píng)分參照Luketal標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行：0分：無(wú)損傷；1分：充血但沒(méi)有潰瘍；2分：充血而且腸壁變厚但沒(méi)有潰瘍；3分：有1處小潰瘍，直徑約0～1 cm；4分：潰瘍較大，直徑約1～2 cm，但腸管與外周臟器無(wú)粘連；5分：潰瘍直徑1～2 cm，腸管增厚，與周圍臟器粘連嚴(yán)重。

1.2.4免疫組織化學(xué)法檢測(cè)PPAR-γ蛋白表達(dá) 采取經(jīng)典的 SABC法，將固定好的石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。每張切片滴加3% H2O2，室溫放置10 min。將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)中進(jìn)行抗原熱修復(fù)，自然冷卻至室溫，滴加5%BSA封閉液，室溫20 min。分別滴加NF-κBp 65一抗，4℃冰箱過(guò)夜。滴加生物素化山羊抗兔IgG，在37℃培養(yǎng)箱中孵育20 min。滴加試劑SABC，在37℃培養(yǎng)箱中孵育20 min。DAB顯色劑，蘇木素輕度復(fù)染3 min；經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。在顯微鏡下觀察結(jié)果，拍片。染色對(duì)照：同一組片中，用PBS代替一抗作孵育，其余步驟同上。

NF-κB p65蛋白表達(dá)結(jié)果判定及測(cè)量方法：NF-κBp65蛋白主要表達(dá)于大鼠結(jié)腸組織中的腸道黏膜及黏膜下層，以胞質(zhì)為主。NF-κB p65表達(dá)陽(yáng)性為胞質(zhì)呈黃綠顆粒染色，顏色越深，表達(dá)越強(qiáng)；未出現(xiàn)黃綠顆粒為陰性。采用BI-2000圖像分析系統(tǒng)之免疫組化分析系統(tǒng)，隨機(jī)選取5個(gè)視野，測(cè)量陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度值。灰度值大，蛋白表達(dá)多，反之則表達(dá)少。

1.2.5RT-PCR法檢測(cè)NF-κB p65 mRNA的表達(dá) 總RNA的提取采用經(jīng)典的Trizol法，應(yīng)用Bio-RAd核酸定量分析儀測(cè)定總RNA的濃度和純度，確保2.0>A260 nm/A280 nm>1.8。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。用cDNA模板對(duì)大鼠內(nèi)參照β-actin及NF-κB p65基因分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物由金唯智生物科技北京有限公司合成，內(nèi)參照β-actin引物序列為:上游引物:5′-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3′，下游引物：5′-AAGGGTGTAAAACGCAGCTC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度292 bp；NF-κB p65引物序列為:上游引物：5′- GAGCAAGCCATTAGCCAGCG -3′，下游引物：5′- CACGGTTATCAAAAATCGGA -3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度173 bp。擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μl，其中cDNA 5 μl；上下游引物各1 μl；MgCl23 μl；10×Reaction Buffer 5 μl；dNTP Mix 1 μl；Tap DNA聚合酶 0.25 μl；無(wú)酶水補(bǔ)足至50 μl。擴(kuò)增參數(shù)為:預(yù)變性95℃ 2 min，95℃變性45 s，退火52℃ 45 s，72℃延伸30 s，共32個(gè)循環(huán)(β-actin為25個(gè)循環(huán))，總延伸72℃ 5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳，在凝膠成像儀上成像，采用QuantityOne圖像分析軟件分析數(shù)據(jù)，獲得各電泳條帶的積分光密度(X)，用β-actin的積分光密度(A)作為內(nèi)參照，計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量(X/A)作為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1一般狀態(tài) 模型組大鼠在造模當(dāng)天開(kāi)始出現(xiàn)稀便，覓食較不主動(dòng)，食量減少，肛周污濁；于1 w內(nèi)體重有所下降，毛色晦暗無(wú)光澤且被糞便沾染，持續(xù)稀便，部分大鼠有血便且肉眼可見(jiàn)，各治療組中痛瀉要方低、中劑量組癥狀緩解較慢，毛色仍稍顯晦暗無(wú)光澤，食量較少，扎堆、稀便及血便癥狀緩解不明顯，不活躍；痛瀉要方高劑量組、SASP組隨著給藥時(shí)間的持續(xù)，癥狀明顯好轉(zhuǎn)，大部分大鼠稀便癥狀消失，基本恢復(fù)正常，糞便呈灰褐色顆粒狀，毛色逐漸轉(zhuǎn)為光亮潤(rùn)澤，食量正常，活躍，體重增長(zhǎng)。各治療組中以痛瀉要方高劑量組和SASP組癥狀改善最為明顯。

2.2結(jié)腸黏膜損傷情況 模型組大鼠結(jié)腸黏膜可見(jiàn)明顯的充血、水腫、潰瘍，腸壁變厚、腸道縮短。經(jīng)痛瀉要方及SASP治療后大鼠結(jié)腸黏膜損傷情況均明顯改善，但各組具體情況不相同，其中痛瀉要方高劑量組及SASP組各大鼠黏膜僅有少量的充血水腫，其余損傷恢復(fù)正常。痛瀉要方高劑量組、SASP組與模型組比較，評(píng)分明顯降低(P<0.01)。痛瀉要方各治療組隨著劑量的增加，評(píng)分逐漸降低，痛瀉要方高劑量組與SASP組相比較，評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.3NF-κB p65蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果 空白組NF-κBp65蛋白少量表達(dá)。模型組表達(dá)較多，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較多；SASP組表達(dá)較弱，數(shù)量較少。痛瀉要方低劑量組表達(dá)中等，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量中等。痛瀉要方高劑量組和中劑量組NF-κB p65蛋白表達(dá)較弱，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較少，與SASP區(qū)別不大。陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值結(jié)果見(jiàn)圖1，表1。

2.4RT-PCR 半定量結(jié)果 空白組大鼠結(jié)腸黏膜NF-κB p65的表達(dá)(0.58±0.29)處于較低水平，用TNBS/乙醇灌腸造模后NF-κB p65表達(dá)量顯著升高(P<0.01)，經(jīng)痛瀉要方治療后與模型組(1.45±0.56)比較，NF-κB p65的表達(dá)水平降低(高、中、低劑量組分別為0.80±0.29、0.87±0.21、1.02±0.33)(P<0.05、P<0.01)，SASP組為0.85±0.27，圖2。

圖1 NF-κB p65蛋白表達(dá)(DAB，×40)

表1 痛瀉要方對(duì)UC大鼠結(jié)腸黏膜損傷評(píng)分及NF-κB p65蛋白表達(dá)水平的影響

Tg：痛瀉要方高劑量組；Tz：痛瀉要方中劑量組；Td：痛瀉要方低劑量組；B：空白組；S：SASP組；Mo：模型組

3 討 論

UC是一種與免疫直接相關(guān)的腸道慢性非特異性炎癥性疾病，臨床表現(xiàn)以腹瀉、黏液膿血便、腹痛、里急后重等癥狀為主。病變可見(jiàn)潰瘍和炎癥，主要局限在結(jié)腸黏膜及黏膜下層，多累及遠(yuǎn)端結(jié)腸和直腸。本病反復(fù)發(fā)作、治愈難度大，容易惡化和癌變，給患者帶來(lái)巨大痛苦。西醫(yī)治療UC以氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑為主，但效果不甚理想且容易復(fù)發(fā)〔1〕。其病因和發(fā)病機(jī)制研究多認(rèn)為與環(huán)境、遺傳、感染等因素有關(guān)。中醫(yī)藥治療UC有明顯優(yōu)勢(shì)，在中醫(yī)辨證論治思想的指導(dǎo)下，其臨床療效顯著。很多經(jīng)典方劑，如烏梅丸、白頭翁湯、痛瀉要方等經(jīng)典方劑已被臨床研究證明有顯著療效〔2〕。但在實(shí)驗(yàn)研究中，研究者多關(guān)注結(jié)腸炎患者寒熱錯(cuò)雜、濕熱內(nèi)蘊(yùn)的中醫(yī)病機(jī)，而對(duì)患者精神情志的紊亂導(dǎo)致病情加重關(guān)注較少。筆者在臨床和前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，很多UC患者因?yàn)椴〕涕L(zhǎng)、病情重、精神壓力大，導(dǎo)致肝氣郁結(jié)，肝郁脾虛而出現(xiàn)精神心理癥狀，而采用具有疏肝健脾功效的痛瀉要方治療，能取得顯著療效。

NF-κB是一種具有多向性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核蛋白因子，廣泛存在于各種組織中，在炎癥反應(yīng)和免疫、病毒感染、細(xì)胞生長(zhǎng)等方面發(fā)揮重要作用〔3〕。有功能活性的NF-κB二聚體大都含p65亞單位，這樣的二聚體具有顯著的促炎活性。目前已有研究證實(shí)UC中炎癥因子分泌的重要調(diào)控者之一就是含p65的NF-κB二聚體的激活〔4〕。UC的發(fā)病與NF-κB p65的表達(dá)密切相關(guān)〔5〕，NF-κB p65參與UC發(fā)病的可能機(jī)制是：當(dāng)NF-κB p65被活化后，可以直接調(diào)節(jié)一系列炎癥細(xì)胞因子、黏附分子等的基因轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)合成，使這些炎癥遞質(zhì)釋放增加，導(dǎo)致結(jié)腸黏膜的病理?yè)p傷〔6〕。另外，當(dāng)脂磷壁酸、肽聚糖、脂多糖等抗原與腸道抗原提呈細(xì)胞PPRs(NOD、TLRs等)相結(jié)合，一方面NF-κB信號(hào)通路被激活〔7，8〕，能自身分泌細(xì)胞因子，另一方面則啟動(dòng)腸道獲得性免疫，被激活的免疫細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子、白介素、干擾素等炎癥因子，而這些炎癥因子又可以反作用于NF-κB信號(hào)通路，使更多的NF-κB蛋白轉(zhuǎn)移到核內(nèi)，調(diào)控多種炎癥因子相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)一步使腸道炎癥反應(yīng)加重，所以如果能阻止NF-κB信號(hào)通路的開(kāi)放，就可能十分有效地治療腸道炎癥〔9～11〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，空白組大鼠結(jié)腸黏膜中NF-κB p65蛋白和基因表達(dá)較弱。模型組大鼠結(jié)腸黏膜中NF-κBp65蛋白和基因表達(dá)量升高，說(shuō)明在UC發(fā)病時(shí)，NF-κB信號(hào)通路可能已被激活。而治療組NF-κB p65蛋白和基因表達(dá)量又明顯低于模型組，說(shuō)明痛瀉要方可能具有阻止NF-κB信號(hào)通路開(kāi)放的效用。本實(shí)驗(yàn)還證實(shí)NF-κB p65蛋白和基因表達(dá)量與結(jié)腸黏膜組織的損傷程度呈正相關(guān)，也支持上述研究結(jié)果。上述研究結(jié)果表明，NF-κBp65的激活參與了UC的發(fā)病。痛瀉要方治療UC的作用機(jī)制可能是發(fā)揮疏肝健脾的整體調(diào)節(jié)作用，起到了激活NF-κB p65的效用。其具體作用機(jī)制可能是通過(guò)降低NF-κB p65mRNA轉(zhuǎn)錄水平，調(diào)控NF-κB p65蛋白的表達(dá)量，發(fā)揮抑制NF-κB p65合成的作用，使NF-κB p65在蛋白水平的表達(dá)減少，一方面可能通過(guò)抑制阻止NF-κB信號(hào)通路的開(kāi)放發(fā)揮其在UC中的抗炎作用，也可能是調(diào)控NF-κB的活化，抑制多種炎癥細(xì)胞因子的釋放和表達(dá)發(fā)揮抗炎作用，其相關(guān)作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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