李 燕 羅建民 袁 軍 王素云 李 杰 楊 潔 王瑞倉 郝洪嶺 王 超 韓 穎

(河北省人民醫(yī)院血液科，河北 石家莊 050000)

SHP-1基因是近年來發(fā)現(xiàn)的抑癌基因之一，是眾多蛋白酪氨酸激酶之一，是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的磷酸化水平,前期實驗〔1〕證實SHP-1基因在急性白血病中發(fā)揮抑癌基因的作用。多發(fā)性骨髓瘤是常見的惡性血液病，目前有關(guān)SHP-1基因與多發(fā)性骨髓瘤關(guān)系的研究國內(nèi)尚無詳細(xì)報道。本研究旨在探討SHP-1基因在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病中的作用及對預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1研究對象 2007年3月至2010年3月我院血液內(nèi)科住院和門診隨訪的患者69例，所有患者均符合張之南主編的血液病診斷中多發(fā)性骨髓瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔2〕，并采用Durie-Salmon(1982年)分期標(biāo)準(zhǔn)。男43例，女26例,發(fā)病年齡45～81歲，中位年齡63歲,好發(fā)年齡55～70歲,>55歲有58例(84%)。其中初治組69例，其中Ⅰ期35例、Ⅱ期21例、Ⅲ期13例；IgG 32例、IgA 18例、IgD 5例、輕鏈型11例、不分泌型3例。根據(jù)2011年NCCN多發(fā)性骨髓瘤治療指南中的EBMT標(biāo)準(zhǔn)定義的治療療效，經(jīng)過治療后，其中完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、輕微緩解(MR),共計42例，無治療反應(yīng)(NC)25例，死亡2例。

1.2治療方案 69例患者中,MP治療組12例,具體為馬法蘭6 mg/d，第1～7天、潑尼松1～1.5 mg·m-2·d-1第1～7天，4 w為1療程。M2治療組15例,具體為卡氮芥125 mg，第1天,環(huán)磷酰胺600 mg·m-2·d-1第1天,長春新堿2 mg，第1天，馬法蘭6 mg/d，第1～7天、潑尼松1 mg/kg，第1～7天，5 w為1療程。VAD治療組31例,具體為長春新堿0.5 mg/d，第1～4天、阿霉素10 mg·m-2·d-1，第1～4 天、地塞米松20 mg/d,第1～4天、第9～12天、第17～20天，4 w為1療程。硼替佐米聯(lián)合化療組11例,硼替佐米劑量為1.0～1.3 mg/m2,第1、4、8、11天，3 w為1療程,與地塞米松或馬法蘭、潑尼松聯(lián)合化療。

1.3分組 將研究對象分為初治組(Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期)、CR+PR+MR組、NC組、正常對照組。觀察各組中SHP-1基因的表達(dá)情況，將初治組分別根據(jù)SHP-1 mRNA的表達(dá)與否分為陽性組與陰性組，觀察兩者陽性組、陰性組與緩解率的關(guān)系。

1.4檢測方法

1.4.1材料 Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液、M-MLV 、Taq DNA 聚合酶、dNTP、隨機六聚體引物均購自Promega公司，Trizol 試劑購自Solarbio 公司。引物由北京賽百盛有限公司合成，SHP-1 的擴增片段長度238 bp，上游引物：5′-GCGGCAGTACTATGC-3′,下游引物：5′-CAGTTCCAACACTCGGTT CTCA-3′。GADPH的擴增片段長度358 bp，上游引物：5′-CGGGAAGCTTGTCATCAA TGG-3′下游引物：5′-GGCAGTGATGGCATGGACTG- 3′。

1.4.2RT-PCR方法檢測SHP-1基因的表達(dá) 病例組及對照組均采集新鮮骨髓液4 ml，以100 U/ml的肝素抗凝。用TRI-REAGENT提取患者和健康對照組總RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20 μl，包括細(xì)胞總RNA 1 μg，在37℃中反應(yīng)60 min，95℃反應(yīng)5 min后終止反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為25 μl，包括逆cDNA 1 μl，MgCl21.5 mmol/L,200 μl的4種dNTP，0.5 μmol/L的引物，1.5 U的Taq酶。以GADPH作為內(nèi)參對照。取10 μl擴增產(chǎn)物，1 g/100 ml瓊脂糖凝膠電泳(90 V，40 min)，溴乙啶染色，紫外投射儀上觀察結(jié)果并照相。RT-PCR擴增條件見表1。

表1 RT-PCR擴增條件

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.5軟件進(jìn)行兩個獨立樣本的非參數(shù)檢驗和χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1SHP-1 mRNA的表達(dá) 所有正常人均能檢測到SHP-1 mRNA表達(dá)，表達(dá)水平為3.309±2.610，用同一實驗條件檢測69例多發(fā)性骨髓瘤患者SHP-1 mRNA，初治組陽性率為42 %，表達(dá)水平為0.165±0.132，PR+CR+MR組表達(dá)陽性率為59.5%,表達(dá)水平為0.608±0.253，NC組表達(dá)陽性率為16%，表達(dá)水平為0.158±0.121，初治、治療無反應(yīng)組多發(fā)性骨髓瘤患者中SHP-1表達(dá)陽性率與表達(dá)水平明顯低于正常對照組(P<0.01)。緩解后的SHP-1 mRNA的表達(dá)升高，但低于正常對照組(P<0.01)。見圖1。Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期多發(fā)性骨髓瘤之間SHP-1 mRNA的表達(dá)水平比較無統(tǒng)計學(xué)意義(0.169±0.119，0.154±0.124，0.172±0.153,P>0.05)。

1～3：正常對照組；4～6：完全緩解、Ⅰ期與無治療反應(yīng)患者組

2.2SHP-1 基因的表達(dá)與臨床療效的關(guān)系 SHP-1基因與多發(fā)性骨髓瘤患者治療反應(yīng)有明顯的相關(guān)性，SHP-1 基因陽性組緩解率(86.2%)明顯高于表達(dá)陰性組(44.7%)(P<0.01)，其中表達(dá)陽性患者中，有治療反應(yīng)的25例，總有效率為86.2%，明顯高于表達(dá)陰性的患者的治療有效率(P<0.01)。

3 討 論

SHP-1基因主要表達(dá)在造血細(xì)胞，被稱為造血細(xì)胞磷酸酶(HCP)。SHP-1磷酸酶是細(xì)胞信號傳導(dǎo)中關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的磷酸化水平，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)各種白血病、惡性淋巴瘤細(xì)胞株中SHP-1 mRNA和SHP-1蛋白水平的下降，其原因在于SHP-1啟動區(qū)的甲基化或SHP-1蛋白合成轉(zhuǎn)錄后阻滯。相反，SHP-1蛋白在非淋巴細(xì)胞株中可以表現(xiàn)為正常表達(dá)或過度表達(dá)。SHP-1位于胞質(zhì)，與細(xì)胞激活、增生、分化和轉(zhuǎn)化等有關(guān)，SHP-1主要通過影響生長因子受體、細(xì)胞因子受體和免疫反應(yīng)相關(guān)受體的活性而發(fā)揮作用，從而抑制細(xì)胞增殖，與腫瘤的形成及生長呈負(fù)相關(guān)〔3〕。目前SHP-1在多發(fā)性的骨髓瘤的作用機制尚不明確，可能通過影響其他的調(diào)控因子發(fā)揮作用，故需要下一步實驗證實。

目前已分離純化的蛋白酪氨酸磷酸酶有40多個，構(gòu)成PTPs家族，SHP-1屬于蛋白酪氨酸磷酸酶家族。人類SHP-1基因定位于12號染色體的p12-p13區(qū),含17個外顯子，全長17 kb〔4〕，外顯子3、4， 5、6，8、10分別編碼N-末端的SH2域，C- 末端的SH2域和催化功能區(qū)。SHP-1蛋白為68 kD的非跨膜酪氨酸磷酸酶，含兩個SH2結(jié)構(gòu)域，一個催化片段和約100個氨基酸殘基的C-末端， SHP-1位于胞質(zhì)，與細(xì)胞激活、增生、分化和轉(zhuǎn)化等有關(guān)，SHP-1主要通過影響生長因子受體、細(xì)胞因子受體和免疫反應(yīng)相關(guān)受體的活性而發(fā)揮作用，從而抑制細(xì)胞增殖，與腫瘤的形成及生長呈負(fù)相關(guān)〔5〕。

總之，SHP-1不僅參與了白血病的發(fā)病，而且在多發(fā)性骨髓瘤中也發(fā)揮了負(fù)性調(diào)節(jié)作用，它的表達(dá)降低或缺失影響著多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生發(fā)展，并為多發(fā)性骨髓瘤的治療中提供理論依據(jù)及靶向治療。

4 參考文獻(xiàn)

1韓 穎，羅建民，賈曉輝，等.急性白血病患者SHP-1與C-kit基因表達(dá)及其臨床意義〔J〕.中國實驗血液學(xué)雜志，2006；14(5)：871.

2張之南，沈 悌.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)〔M〕.第2版.北京：科學(xué)出版社，1998:373-80.

3Hsu HC,Shultz LD,SU X,etal.Mutation of the hematopoietic cell phosphatase (Hcph) gene is associated with resistance to γ-irradiation induced apoptosis in Src homology protein tyrosine phosphatase(SHP)-1-deficient “Motheaten” mutant mice〔J〕.J Immunol,2001；166:772-80.

4Tsui HW,Hasselblatt K,Martin A,etal.Molecular mechanisms underlying SHP-1 gene expression〔J〕.Eur J Biochem,2002；269(12):3057-64.

5Jones PA, Baylin SB.The fundamental role of epigenetic events in cancer〔J〕.Nat Rev Genet，2002；3(6)：415-28.