靳文劍 張焜和 陳火國(guó) 羅慶豐

(南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院消化系,江西 南昌 330029)

肝細(xì)胞癌(HCC)是我國(guó)常見惡性腫瘤之一，腫瘤相關(guān)死亡率居第3位〔1〕。β-連環(huán)蛋白(β-Catenin)是Wnt信號(hào)通路的核心元件，在多種腫瘤組織中β-Catenin通過突變維持蛋白穩(wěn)定性，導(dǎo)致Wnt-β/Catenin信號(hào)通路異常激活，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展〔2〕。S期激酶相關(guān)蛋白2(Skp2)是泛素連接酶E3復(fù)合體中負(fù)責(zé)底物識(shí)別的關(guān)鍵因子，特異性降解多種蛋白因子，導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖〔3〕。p27是Skp2的靶蛋白之一，其通過將細(xì)胞周期阻滯在G1期從而抑制細(xì)胞增殖，其表達(dá)異常是腫瘤形成的重要因素之一〔3〕。本研究采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)β-Catenin、Skp2和p27蛋白在老年HCC及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況，分析三者在HCC組織中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，并進(jìn)一步探討β-Catenin、Skp2和p27蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性，為臨床提供具有潛在應(yīng)用價(jià)值的分子標(biāo)記和治療新靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1臨床資料 收集2008年1月至2012年12月我院病理科保存的HCC及對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本56例，其中男44例，女12例，年齡60～78〔平均(61±4.5)〕歲；Edmonson分級(jí)：Ⅰ+Ⅱ級(jí)32例，Ⅲ+Ⅳ級(jí)24例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ級(jí)33例，Ⅲ+Ⅳ級(jí)23例。所有患者術(shù)前均未行放射、化療及射頻消融治療，所有組織標(biāo)本經(jīng)術(shù)后病理學(xué)證實(shí)為HCC。

1.2免疫組織化學(xué)染色 兔抗人β-Catenin多克隆抗體(sc-1496-R)、Skp2多克隆抗體(sc-7164)和p27多克隆抗體(sc-528)均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。對(duì)石蠟塊進(jìn)行4 μm連續(xù)切片，經(jīng)過二甲苯脫蠟和酒精梯度水化后，抗原修復(fù)液(檸檬酸+檸檬酸鈉)進(jìn)行熱抗原修復(fù)，3% H2O2孵育15 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，10%山羊血清室溫封閉30 min，將以1∶100比例稀釋的β-Catenin、Skp2和p27抗體加于標(biāo)本后，4℃孵育過夜。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3 min 3次，滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗工作液，室溫孵育30 min。PBS沖洗3 min 3次，滴加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30 min。DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，1%鹽酸酒精分化，稀氨水反藍(lán)，酒精和二甲苯梯度脫水至透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察、成像系統(tǒng)拍照，統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。用染色強(qiáng)度聯(lián)合陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分；染色強(qiáng)度分為4個(gè)等級(jí)：陰性=0分；弱陽(yáng)性=1分；中度=2分；強(qiáng)陽(yáng)性=3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比分5個(gè)等級(jí)：≤5%=0分；6%～25%=1分；26%～50%=2分；51%～75%=3分；>75%=4分。染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分相乘≥1分則認(rèn)為β-Catenin、Skp2或p27蛋白陽(yáng)性表達(dá)〔4〕。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件，蛋白表達(dá)差異和臨床病理參數(shù)分析均采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法，蛋白表達(dá)相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)。

2 結(jié) 果

2.1HCC及對(duì)應(yīng)癌旁組織中β-Catenin、Skp2和p27的表達(dá) β-Catenin、Skp2和p27在HCC組織中分別為55.4%(31/56)、44.6%(25/56)和14.3%(8/56)，在對(duì)應(yīng)癌旁組織中分別為14.3%(8/56)、10.7%(6/56)和53.6%(30/56)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.811、16.102、19.277，均P=0.000)。β-Catenin主要定位于細(xì)胞膜，Skp2主要定位于細(xì)胞核，而p27主要定位細(xì)胞質(zhì)和胞膜。見圖1。

圖1 β-Catenin、Skp2和p27在各種組織中的表達(dá)(SP，×400)

2.2β-Catenin、Skp2和p27蛋白表達(dá)與HCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系 HCC組織中β-Catenin陽(yáng)性表達(dá)與肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和Edmonson分級(jí)有關(guān)(χ2=21.624、22.406，P=0.000)；Skp2陽(yáng)性表達(dá)與肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、Edmonson分級(jí)和TNM分期有關(guān)(χ2=28.561、25.441、34.387，均P=0.000)；p27陽(yáng)性表達(dá)與Edmonson分級(jí)和TNM分期有關(guān)(P=0.008、0.016)。見表1。

2.3β-Catenin、Skp2和p27蛋白在HCC組織中表達(dá)的相關(guān)性 HCC組織中，β-Catenin與Skp2蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.571，P=0.002)；β-Catenin與p27蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.429，P=0.029)；Skp2與p27蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.667，P=0.001)。

表1 β-Catenin、Skp2和p27蛋白表達(dá)水平與HCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系(n=56,n)

1)Fisher精確概率法

3 討 論

β-Catenin最早是在結(jié)直腸癌中被發(fā)現(xiàn)與腫瘤形成相關(guān)，其與腺瘤性結(jié)腸息肉病(APC)腫瘤抑制基因產(chǎn)物形成復(fù)合體，研究發(fā)現(xiàn)包含野生型APC基因的結(jié)腸癌中存在致癌突變的β-catenin基因，提示了β-Catenin在調(diào)控細(xì)胞增殖過程中的重要性〔5〕。突變的β-Catenin蛋白能夠逃避APC靶向介導(dǎo)的降解從而更加穩(wěn)定，盡管β-Catenin突變率較低，但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤、HCC、肝母細(xì)胞瘤、Wilm's腫瘤、前列腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、髓母細(xì)胞瘤、甲狀腺癌、胃癌、腎癌、骨肉瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤和毛母質(zhì)瘤等一系列腫瘤中存在β-Catenin突變，這些數(shù)據(jù)高度提示β-Catenin信號(hào)通路反?？赡芘c多種人類惡性腫瘤的發(fā)生相關(guān)〔2〕。另外在大部分人類腫瘤中都存在β-Catenin下游靶蛋白如c-Myc和細(xì)胞周期蛋白(cyclin)D1過表達(dá)，更進(jìn)一步支持β-Catenin在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要性〔6〕。本研究提示β-Catenin可能與HCC發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

p27是細(xì)胞周期抑制蛋白CIP/KIP家族成員，通過與細(xì)胞周期蛋白-細(xì)胞周期蛋白依賴激酶復(fù)合體結(jié)合抑制其活性〔7〕。p27高表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G1期，細(xì)胞停止增殖，在一系列的腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了p27表達(dá)異常，提示p27低表達(dá)在促進(jìn)腫瘤形成中發(fā)揮重要作用〔8〕。p27表達(dá)受轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平機(jī)制調(diào)控，而最重要的調(diào)控機(jī)制是Skp2介導(dǎo)的泛素依賴蛋白水解通路，F(xiàn)-盒蛋白Skp2靶向降解p27、p21、p57和p130，在細(xì)胞周期中Skp2與p27的表達(dá)水平相反，Skp2-p27軸參與了許多腫瘤的形成和進(jìn)展〔9〕。Skp2在淋巴瘤形成中發(fā)揮重要作用，在人類淋巴瘤組織中其表達(dá)與腫瘤病理分級(jí)呈正相關(guān)而與p27表達(dá)呈負(fù)相關(guān)〔10〕。本研究也發(fā)現(xiàn)，HCC組織中Skp2陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織，而p27的表達(dá)情況則相反。另外結(jié)果提示Skp2-p27軸參也與了HCC的發(fā)生發(fā)展。

研究發(fā)現(xiàn)p27表達(dá)缺失誘導(dǎo)Wnt/β-Catenin信號(hào)通路活化，共表達(dá)p27可以抑制β-Catenin誘導(dǎo)的Smad7表達(dá)，提示Skp2-p27軸與β-Catenin之間存在相互作用〔11〕。本研究結(jié)果提示β-Catenin、Skp2和p27在HCC發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中可能相互作用。

綜上，β-Catenin、Skp2和p27在老年HCC組織中的表達(dá)異常且與惡性病理參數(shù)有關(guān)，三者異常表達(dá)密切相關(guān)，并可能成為具有潛在應(yīng)用價(jià)值的分子標(biāo)記和治療新靶點(diǎn)。

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