李 偉 胡紅梅 楊亞軍 楊贛軍 孫 弋 孫新明

(井岡山大學臨床醫(yī)學院，江西 吉安 343000)

男性生殖毒性的研究中，環(huán)境污染(如蔬菜中農藥、洗滌劑、家庭常用餐具)引起的雌激素樣物質濃度升高等對男性生殖健康的威脅越來越引起人們的重視；近代藥理研究發(fā)現(xiàn)，不少臨床常用的中藥具有雌激素樣功效，如甘草、補骨脂等可促進雌性動物乳腺發(fā)育和子宮明顯增重及血清雌激素水平升高〔1〕，其雌激素樣作用是否與環(huán)境雌激素一樣具有男性生殖毒性的作用，目前未見報道。研究旨在探討中藥材雌激素樣作用對睪丸的毒性作用，為研究男性不育不孕癥的發(fā)生機制及甘草等含雌激素樣作用中藥材的臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1采用清潔級BABL/c雄鼠20只(購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司)；市售藥用甘草采用超聲提取法和樹脂吸附技術自制成浸膏(含甘草提取物62.5 mg/ml)后用磷酸鹽緩沖液(PBS)配制成10 mg/ml藥物濃度，過濾除菌，置冰箱冷藏備用；實驗在井岡山大學醫(yī)學院中心動物實驗室〔實驗動物使用許可證號：SYXK(贛)2012-0001〕完成。主要試劑：DMEM培養(yǎng)液、Percoll細胞分離液(Gibco公司)；優(yōu)質胎牛血清(Hyclone公司)；MTT試劑盒(上海創(chuàng)翼生物科技有限公司)；姬姆薩染色液(380050-G)。

1.2方法

1.2.1小鼠生精細胞的分離培養(yǎng) 按照文獻〔2〕的方法分離培養(yǎng)小鼠生精細胞：在無菌條件下取出生后6～8 d小鼠(約10只)雙側睪丸，放人無菌平皿中，在加有1%青霉素和鏈霉素的PBS中剝離睪丸白膜；將分離后的組織放人加有P B S的離心管，用吸管吹打以分散曲細精管；用D-hanks液配制的1 g/L膠原酶Ⅳ加入離心管中(體積共2.5 ml)，將離心管置入37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中15 min，然后 1 000 r/min離心1 min后除去上清，加入1 g/L透明質酸酶和0.25%胰蛋白酶，轉入無菌培養(yǎng)皿中，放入37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱5 min后取出，顯微鏡下觀察到大量游離的單細胞和小細胞團；轉入無菌離心管，加入含有10%(BBS)和1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液至總體積為10 ml；1 300 r/min離心5 min，棄上清后再加入10 ml DMEM培養(yǎng)液；用100 μm濾網(wǎng)過濾后將濾液轉入離心管，1 300 r/min離心5 min；棄上清，向細胞加入0.5 ml DMEM培養(yǎng)液制成單細胞懸液，采用Percoll梯度分離液分離精原細胞。

1.2.2密度梯度離心 分別制備密度為1.021、1.031、1.043、1.056、1.067和1.079 g/ml的Percoll梯度液，再用長針頭注射器將已制備好的每組Percoll梯度液按密度從高到低逐層放置到10 ml離心管中。將細胞懸液置于最上層，以1 400 r/min離心25 min。用吸管將位于1.056和1.067梯度間的細胞帶取出，移至另一10 ml離心管中。加入5倍體積的D-Hanks液稀釋，以1 000 r/min離心10 min，棄上清，重復上述過程2次。再加入2 ml新鮮培養(yǎng)液，調整細胞密度至3×106個/ml，由此制備的細胞懸液中，多數(shù)為生精細胞。

1.2.3生精細胞的培養(yǎng) 將調整好細胞密度的細胞懸液接種于放置有多聚賴氨酸處理的蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，每孔1.5～3 ml，置CO2培養(yǎng)箱中(37℃、5%CO2、95%空氣)培養(yǎng)。24 h后首次換液，以后每隔1 d換液。

1.2.4生精細胞的形態(tài)學觀察 在倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)學改變并拍片記錄。

1.2.5生精細胞姬姆薩染色 細胞培養(yǎng)達到指定時間后，姬姆薩染色。配置工作液：PBS 1 ml，蒸餾水9 ml混勻，即可。取出細胞，用甲醇固定 2～3 min； 將細胞爬片放置染色架上，滴加稀釋好的染色液，使覆蓋全部細胞，室溫染色15～30 min。 用自來水緩慢從玻片一端沖洗(注意勿先倒去染液或直接對細胞沖洗)，晾干后鏡檢。

1.2.6MTT法檢測細胞毒性 在96孔板加入細胞100 μl/孔(約1×104)，置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；加入適當濃度的受試化合物；將96孔板在37℃，含5%CO2及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當時間；將5×MTT用 Dilution Buffer稀釋成1× MTT；每孔加50 μl 1× MTT，在37℃孵育4 h，使MTT還原為甲臜；吸出上清液，每孔加150 μl DMSO使甲臜溶解，用平板搖床搖勻；酶標儀在570 nm波長處檢測每孔的光密度。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1形態(tài)學觀察 生精細胞接種后大部分懸浮在基質細胞飼養(yǎng)層上，少量的開始黏附，細胞呈圓形； 12 h后見有少量體積較大的懸浮細胞開始死亡，體積較小的貼壁細胞開始分裂增殖，增殖的細胞大小均一，可呈單個或鏈狀，細胞間可見由于細胞在分裂時胞質未完全分開形成的細胞間橋，見圖1，圖2，圖3，這與文獻報道的精原干細胞的形態(tài)學特征相符合〔2〕。

2.2姬姆薩染色結果 姬姆薩染色顯示生精細胞形態(tài)完整，呈圓形，胞質呈灰色，胞核較圓，胞膜邊界較清晰，加藥組細胞染色相對正常組變淺，核染色質著色物質變弱變少。

圖1 對照組生精細胞形態(tài)(相差顯微鏡，×400)

圖2 含藥物1 μg/ml實驗組生精細胞形態(tài)(相差顯微鏡，×400)

圖3 含藥物60 μg/ml實驗組生精細胞形態(tài)(相差顯微鏡，×400)

2.3MTT法檢測不同濃度甘草浸膏對于生精細胞的毒性作用 含藥物1、 10、100 μg/ml的實驗組培養(yǎng)24 h的細胞成活率分別為87.0%。MTT均值0.459、68.6%，MTT均值0.365、46.5%，MTT均值0.251。

3 討 論

在男性生殖毒性的研究中，環(huán)境污染(如蔬菜中農藥、洗滌劑、家庭常用餐具)引起的雌激素樣物質濃度升高等對男性生殖健康的威脅越來越引起人們的重視；而具有雌激素樣功效的常用中藥-甘草是否與環(huán)境雌激素一樣具有男性生殖毒性的作用，這非常值得探討，本實驗按照文獻〔2〕的方法分離培養(yǎng)小鼠生精細胞，并分為對照組和實驗組，實驗組的培養(yǎng)液是在對照組的基礎上分別加1、10、100 μg/ml的甘草浸膏，以觀察其生物學特征，結果表明細胞生長分裂受到一定得抑制或有些細胞凋亡，隨著藥物濃度的增加，細胞成活率逐漸下降，到了100 μg/ml時，細胞成活率不及50%。這進一步說明甘草對男性生殖細胞有一定的毒害作用，且隨濃度的增加而增加。甘草主要成分有甘草酸、甘草甙等，具有抗炎、抗病毒，和保肝解毒及增強免疫功能等作用，甘草酸有糖皮質激素樣藥理作用而無嚴重不良反應，甘草酸還具有降血脂與抗動脈粥樣硬化作用，阻止動脈粥樣硬化的形成，現(xiàn)代臨床也應用甘草于補腎生精合劑、生精湯中〔3〕，但甘草對生精細胞的具體作用機制及是否有可逆性將需要作進一步的研究。

4 參考文獻

1孫 巖，尤 君.注意甘草甜素的不良反應〔J〕.中國誤診學雜志，2008；8(12):3018.

2張小麗，高英茂，趙舒武，等.生精細胞的體外培養(yǎng)〔J〕.山東大學學報，2005；43(10):881-4.

3張宏偉.生精湯聯(lián)合復方甘草鋅膠囊治療弱精癥的臨床分析〔J〕.山西醫(yī)藥雜志，2007；36 (3):200.