1.云南省臨滄市食品藥品檢驗(yàn)所，云南 臨滄 677000；2.云南省曲靖市食品藥品檢驗(yàn)所，云南 曲靖 655000；3.大理學(xué)院，云南 大理 671000

HPLC法測(cè)定補(bǔ)腎強(qiáng)身片中原兒茶酸的含量

穆天慧1方慧祥2黎海存3

1.云南省臨滄市食品藥品檢驗(yàn)所，云南 臨滄 677000；2.云南省曲靖市食品藥品檢驗(yàn)所，云南 曲靖 655000；3.大理學(xué)院，云南 大理 671000

目的建立高效液相色譜法測(cè)定補(bǔ)腎強(qiáng)身片中原兒茶酸的含量方法。方法采用色譜柱為Agilent HC-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-1%冰醋酸(3.5∶96.5)； 柱溫為30℃；流速：1.0ml.min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：260nm；進(jìn)樣量：10μl。結(jié)果原兒茶酸回歸方程Y=3081.5151X-0.9753，r=0.9998(n=5)，濃度在0.05888～0.35328μg.ml-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率97.7﹪，RSD為0.96﹪。結(jié)論HPLC法準(zhǔn)確、快速，簡(jiǎn)便可靠，可用于補(bǔ)腎強(qiáng)身片中原兒茶酸的含量測(cè)定。

HPLC法；補(bǔ)腎強(qiáng)身片；原兒茶酸；含量測(cè)定

補(bǔ)腎強(qiáng)身片由淫羊藿、菟絲子、金櫻子、女貞子、狗脊(燙)五味中藥組成，具有補(bǔ)腎強(qiáng)身的功效，用于腰酸足軟，頭暈耳鳴，眼花心悸，陽(yáng)萎遺精 ?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十五冊(cè)(WS3-B-2907-98)，其標(biāo)準(zhǔn)簡(jiǎn)單，無含量測(cè)定的項(xiàng)目[1]。為更好地控制補(bǔ)腎強(qiáng)身片的質(zhì)量，確保臨床療效，參照中國(guó)藥典[2]及文獻(xiàn)[3，4]，建立HPLC法測(cè)定補(bǔ)腎強(qiáng)身片中原兒茶酸的含量的方法，本實(shí)驗(yàn)選擇原兒茶酸為指標(biāo)，用HPLC法對(duì)補(bǔ)腎強(qiáng)身片進(jìn)行含量測(cè)定。

1 儀器與試劑

Agilent Technologies 1200 Series高效液相色譜儀(G1311A四元泵，G1329A自動(dòng)控溫進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G1315D二極管陣列檢測(cè))；超聲波淸洗儀(中船七院七二六所)；塞多利斯CP324S電子天平。原兒茶酸對(duì)照品(批號(hào)：809-9201，中國(guó)藥品生物制品檢定所)。乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，冰醋酸為分析純。補(bǔ)腎強(qiáng)身片(批號(hào)：201206003、201206004、201206006，葵花藥業(yè)集團(tuán))和陰性樣品。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent HC-C18(4.6mm×250mm，5μm)，流動(dòng)相：乙腈-1%冰醋酸(3.5∶96.5)；流速：1.0ml.min-1；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：260nm；進(jìn)樣量：10μl。原兒茶酸的保留時(shí)間約為15.32min 。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取原兒茶酸對(duì)照品0.0184g，置50ml容量瓶中，加甲醇-1%冰醋酸(70∶30)使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，再精密量取2ml，置50ml容量瓶中，加甲醇-1%冰醋酸(70∶30)稀釋至刻度，搖勻，即得0.01472mg.ml-1原兒茶酸對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取補(bǔ)腎強(qiáng)身片30片，去糖衣，精密稱定，研細(xì)，精密稱取細(xì)粉約2.5g(相當(dāng)于10片的量)置150ml具塞錐形瓶中，加入0.1mol/L的鹽酸3ml潤(rùn)濕10min，加乙酸乙酯20ml超聲30min，方冷，濾過，殘?jiān)靡宜嵋阴?0ml洗滌，合并濾液與洗滌液，水浴上蒸干，殘?jiān)蛹状?1%冰醋酸(70∶30)溶解，定溶至25ml容量瓶中，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按處方比例及制法，取除狗脊(燙)的其他藥材，制得陰性樣品。再按供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照樣品溶液。

2.3 線性實(shí)驗(yàn) 吸取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液，用0.45μm的微孔濾膜濾過。分別精密吸取濾液4、10、16、20、24μl進(jìn)樣，濃度分別為0.05888、0.14720、0.23552、0.29440、0.35328μg.ml-1。以濃度X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，原兒茶酸的濃度在0.05888～0.35328μg.ml-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，Y=3081.5151X-0.9753，r=0.9998(n=5)。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取“2.2.1項(xiàng)”下對(duì)照品溶液10μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)原兒茶酸的峰面積，RSD為0.11%。表明所選色譜條件系統(tǒng)穩(wěn)定。

2.5 空白實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)照品溶液，供試品溶液，陰性對(duì)照溶液各10μl進(jìn)樣，結(jié)果，在對(duì)照品和供試品色譜相應(yīng)的保留時(shí)間，陰性樣品無色譜峰，表明陰性樣品不干擾測(cè)定。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一樣品，按照“2.2.2項(xiàng)”下制備，分別在0、4、10、16、24h測(cè)定峰面積，RSD為0.21%，說明原兒茶酸甲醇-1%冰醋酸(70∶30)溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào)：201206004)4份，按“2.2.2項(xiàng)”下制備，測(cè)定原兒茶酸的含量，其含量的RSD為0.31%。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的補(bǔ)腎強(qiáng)身片細(xì)粉(批號(hào)：201206004) 4份，精密稱定，加入原兒茶酸對(duì)照品適量，按“2.2.2項(xiàng)”下操作。測(cè)得原兒茶酸的回收率見表1。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果(n=4)

2.9 樣品測(cè)定結(jié)果 分別取3種不同批號(hào)的補(bǔ)腎強(qiáng)身片，按“2.2.2項(xiàng)”下的方法操作，以外標(biāo)法計(jì)算原兒茶酸的含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[3-4]及中國(guó)藥典[2]，檢測(cè)波長(zhǎng)采用260nm。

3.2 流動(dòng)相的考察 參考中國(guó)藥典[2]及文獻(xiàn)報(bào)道[3][4]，流動(dòng)相為乙腈-1%冰醋酸(5∶95)和乙腈-0.2%磷酸溶液(4∶96)下都能出峰，但分離效果及峰形不理想，因此在反復(fù)驗(yàn)證及本實(shí)驗(yàn)環(huán)境下，流動(dòng)相為乙腈-1%冰醋酸(3.5∶96.5)時(shí)，出峰的保留時(shí)間合適，分離效果及峰形較好，所以本實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相比例為乙腈-1%冰醋酸(3.5∶96.5)。

3.3 提取方法的考察 第一種提取法參照中國(guó)藥典[2]，精密稱定樣品后，再精密加入甲醇-1%冰醋酸(70∶30)混合溶液25 mL，稱定重量，超聲提取(功率300 W，頻率45 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇-1%冰醋酸(70∶30)混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液進(jìn)樣分析；第二種提取法參考文獻(xiàn)[3]即“2.2.2項(xiàng)”下的提取方法。第三種提取法按“2.2.2項(xiàng)”下的提取方法，將0. 1mol/L的鹽酸3ml換為0.01 mol/L的鹽酸10ml。按樣品測(cè)定方法測(cè)定，含量分別為0.5020mg/片，0.5145mg/片，0.3792mg/片，且第一種方法提取的樣品，雜峰多。根據(jù)上述結(jié)果，最終確定第二種提取方法為本試驗(yàn)的提取方法。

3.4 結(jié)論 該方法準(zhǔn)確、快速，簡(jiǎn)便可靠，可用于補(bǔ)腎強(qiáng)身片中原兒茶酸的含量測(cè)定。

[1] WS3-B-2907-98.補(bǔ)腎強(qiáng)身片[S].1998.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M]．北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：209.

[3] 南勁松，孫海濤，吳艷麗，等.高效液相色譜法測(cè)定補(bǔ)血調(diào)經(jīng)片中原兒茶酸的含量[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20(2)：437-438.

[4] 林春華，朱品業(yè)，胡家熾，等.高效液相色譜法測(cè)定壯腰健腎丸原兒茶酸含量[J].中國(guó)中藥雜志，1996，21(5)：288.

DeterminationofProtocatechuicacidinBushenqiangshentabletsbyHPLC

Mu Tian-hui1Fang Hui-xiang2Li Hai-cun3

1.Lincang Institute for Food and Drug control 677000；2.Qujing Institute for Food and Drug control 655000；3.Da Li Universerty 671000 ,Yunnan

Objective：To establish an HPLC method for determination of Protocatechuic acid in Bushenqiangshen tablets. Methods：The Agilent HC-C18 column(4.6mm×250mm，5μm)was used at a column temperature of 30℃. The mobile phase consisted of acetonitrile - 1% glacial acetic acid in water (3.5∶96.5) and detected with UV 260nm.The flow rate was 1.0mL·min-1and the injected volume was 10μL. Results： A good linear concentration range for Protocatechuic acid was 0.05888～0.35328 μg.mL-1(r=0.9998 ,n=5).The average recoveries was 97.7% with RSD of 0.96% . Conclusion：The method is rapid, simpie and accurate , which can be used for the quality control of Protocatechuic acid of Bushenqiangshen tablets.

HPLC；Bushenqiangshen tablets；Protocatechuic acid；determination

R285.6

A

1007-8517(2014)09-0013-02

2014.03.10)