孟凡榮 陳琛 李永文 萬海粟 周清華

在基因序列中引入點突變，是研究基因的結(jié)構(gòu)和功能及其相關(guān)性的重要手段[1,2]。例如，當所研究的基因是蛋白編碼基因時，在蛋白編碼框架內(nèi)引入點突變，就可以改變蛋白編碼序列，而突變基因在相關(guān)研究體系中功能的變化，則可以為該基因的功能特點的研究提供依據(jù)。體外基因突變已經(jīng)成為分子生物學實驗室的一項常規(guī)工作。為適應(yīng)這一需要，已經(jīng)有多種在基因序列中引入點突變的方法可以使用[3-5]。目前最常用的方法QuickchangeTM占據(jù)了主流的位置，當然，也存在其它許多可以實現(xiàn)基因定點突變的方法，但這些方法中，基本都是對在單一位置引入點突變較為有效，而對在基因序列的多個位點引入突變則并不有效。為解決這一問題，有Ko等[6]提供了一種可以在體外基因序列中引入多個點突變的方法，但這種方法含有瓊脂糖凝膠電泳的步驟，以及其后的DNA片段的回收，操作過程極為繁瑣，因此，并不太適合作為實驗的常規(guī)方法使用。本研究在這些方法的基礎(chǔ)上，提供一種非常簡便有效的在基因序列中引入多位點突變的方法，本研究所提供的方法主要實驗步驟可在一天之內(nèi)完成，突變效率可接近100%[7-9]。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究使用的基因序列是pEN載體，其中含有nm23和綠色熒光蛋白（enhanced green fluorecence protein,EGFP）之間的融合基因，該載體為實驗室常規(guī)保存。PCR反應(yīng)所用試劑盒PrimeSTAR HS DNA Polymerase（DR010A），T4DNA連接酶（T4 DNA ligase, D2011），DNA純化DNA Fragment Purification Kit（DV807A,TaKaRa）及DH5alpha菌株為宿主，均購自Takara（大連）公司。限制性內(nèi)切酶Esp 3I及Dpn I為Fermentas產(chǎn)品。質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 在一段位于pEN載體的基因序列中引入多位點的定點突變時，針對每一個突變位點，合成一對引物，待突變的位點則位于該引物序列之中，而每一個引物中均含有限制性內(nèi)切酶Esp 3I位點。則每個擴增片段的兩端都含有一個Esp 3I位點。實驗所用的突變引物由Takara合成，具體序列見表1。

1.2.2 PCR產(chǎn)物制備 PCR反應(yīng)利用PrimeSTAR HS DNA Polymerase及其中的反應(yīng)試劑（DR010A, Takara）進行。反應(yīng)體系為100 μL，含有以下成分：1×Prime STAR buffer；dNTP Mixture，其中dATP、dGTP、dCTP、dTTP的終濃度均0.25 nM，Primer A、Primer B的終濃度均為0.25 μM，質(zhì)粒DNA（pEN載體）20 ng，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 2.5 U。PCR反應(yīng)循環(huán)條件為：預(yù)變性95oC、30 s后進入循環(huán)，98oC、10 s變性，62.5oC、30 s退火，72oC、5 min復性，共28個循環(huán)，繼續(xù)72oC延伸10 min后終止反應(yīng)，產(chǎn)物4oC保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 模板質(zhì)粒DNA的去除 將上一步驟的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)入37oC水浴，直接加入限制性內(nèi)切酶DpnI 40 U（Fermentas）酶切1 h-2 h。對所得DNA產(chǎn)物進行純化，所用試劑盒為DNA Fragment Purification Kit（DV807A,TaKaRa），30 μL水復溶。

1.2.4 連接末端的形成及連接反應(yīng) 對擴增產(chǎn)物用Esp 3I對其進行酶切，從而將引物序列中非特異的序列部分去除并形成連接末端，具體反應(yīng)條件為：將以上純化后的擴增產(chǎn)物放入50 μL酶切體系中，其中含有Esp 3I量為20 U（Fermentas），其它條件與廠家要求一致，37oC水浴2 h。實驗接著對所得酶切產(chǎn)物進行純化，所用試劑盒為DNA Fragment Purification Kit（DV807A, TaKaRa）。最后，所得DNA純化產(chǎn)物進行連接反應(yīng)（T4 DNA Ligase,Takara），16oC水浴1 h-2 h。

1.2.5 化學轉(zhuǎn)化DH5alpha感受態(tài)細胞 取所得連接產(chǎn)物1 μL，轉(zhuǎn)入100 μL感受態(tài)細胞混勻，冰上30 min，42oC水浴1 min，然后將受體菌加入到預(yù)熱至37oC未加抗生素的LB培養(yǎng)基懸浮，37oC搖床培養(yǎng)1 h，200 rpm/min。涂布于含卡那霉素的LB平板，37oC培養(yǎng)過夜后挑單菌落鑒定質(zhì)粒。

1.2.6 突變質(zhì)粒的鑒定和基因序列的測定 質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，含有突變基因的質(zhì)粒，利用Sanger測序法進行測序驗證（華大基因科技服務(wù)有限公司，北京）。

2 結(jié)果

2.1 在基因序列中引入多位點突變的流程 在一個位于某個表達載體的基因序列中引入多位點的定點突變時，針對每一個突變位點合成一對引物，待突變的位點則位于該序列之中，而每一個引物中均含有一個合適的Type IIs類的限制性內(nèi)切酶的位點，一般情況下，我們使用Esp 3I位點。當然，也有許多其它的該類型的限制性內(nèi)切酶位點可以使用。這一類限制性內(nèi)切酶的特點是，其在底物DNA序列上的識別位點與其在底物序列上的酶切位點是分離的[10]。常用的Esp 3I限制性內(nèi)切酶的識別位點和酶切位點被置于突變引物序列的5’端，而突變位點和周圍的特異序列，則被置于突變引物序列的3’端。如圖1所示，實驗首先利用常規(guī)的PCR反應(yīng)，對鄰近兩個突變位點之間的序列進行擴增，假定需要在基因序列中引入4個位點的突變，則可以將載體分別擴增為4個片段，其中，每個擴增片段的兩端都含有一個Esp 3I位點，然后借助Dpn I限制性內(nèi)切酶，對擴增產(chǎn)物進行酶切，以消除作為擴增模板的質(zhì)粒，防止其在后續(xù)的實驗中形成假陽性克隆[11]。實驗接著利用對應(yīng)的Type IIs類的限制性內(nèi)切酶，對擴增產(chǎn)物進行酶切，從而將引物序列中非特異的序列部分去除并形成連接末端，然后，借助T4 DNA連接酶做連接反應(yīng)，以形成突變載體。和其它類似的方法比較，我們這里提供的方法中，沒有任何DNA電泳和回收的步驟，因此，在實驗操作時非常簡便易行。

2.2 在nm23-EGFP融合基因序列中引入3個和4個位點的突變 為驗證以上實驗方法是否可行，我們利用在pEN載體中含有的nm23-EGFP融合基因中引入3個-4個突變來進行驗證[12]。如圖2所示，實驗共選擇在4個位點，分別用下劃線標注，被稱為突變位點site1、site2、site3、site4。每個位點對應(yīng)的突變引物分別是：site1A1B、site2A2B、site3A3B、site4A4B。每個引物的5’端含有一個屬于Type IIs類限制性內(nèi)切酶的Esp 3I位點。這些突變有的屬于難度較大的突變類型，因此可以驗證本研究所提供的方法的有效性。

表 1 實驗所使用的突變引物序列Tab 1 Oligonucleotides used in the experiments

圖 1 Esp 3I酶切位點及實驗流程示意圖Fig 1 The recognition sequence of Esp 3I and the schematic representation of the method

在這個實驗中，如果引入3個位點的突變，則有4種組合，即123、124、234、134，而4個位點的突變只有一種，即1234。實驗對所有這些組合進行了測試，它們分別被稱為突變123、124、234、134、1234。實驗分別利用兩個鄰近的位點引物做PCR擴增，對于需要引入3個位點的突變的情形，先擴增出3個片段，而對于需要引入4個位點突變的情形，共需要擴增出4個片段。然后，實驗利用Esp 3I對其進行酶切，并借助連接反應(yīng)將酶切后片段連接在一起，形成所需要的突變載體。實驗利用基因測序的方法對所獲得突變載體克隆進行了驗證，如圖3A所示，突變123、124、234、134、1234的成功率分別為：7/7（100%）、10/10（100%）、8/9（89%）、9/9（100%）、12/12（100%），成功率接近100%，說明方法的有效性。圖3B中所示為四個突變位點突變后堿基，其中，突變位點site1為9 bp長度的置換突變，突變位點site2為一個氨基酸編碼序列的改變，突變位點site3為13bp的序列刪除，突變位點site4為單氨基酸編碼轉(zhuǎn)換。突變后序列在所設(shè)計引物中均有所體現(xiàn)，在表1中用黑體字標出。實驗測序結(jié)果充分驗證了方法的有效性。

圖 2 nm23-EGFP融合基因序列中的突變位點Fig 2 Sequence of the nm23-EGFP fusion gene and the desired mutagenic sites

圖 3 實驗突變結(jié)果及測序圖。A：突變1-2-3、1-2-4、2-3-4、1-3-4和1-2-3-4的突變成率；B：四個位點的突變測序圖。Fig 3 Sequencing results of the mutants. A: mutational rate of the mutants; B: sequencing maps of the mutants.

3 討論

體外基因定點突變技術(shù)，已經(jīng)是分子生物學實驗中的一個常用技術(shù)，但多數(shù)相關(guān)的實驗方法，只適用于單一位點的序列突變，而對于在目標基因中的多個位點引入突變，實驗程序則非常繁瑣。本研究所提供的實驗方法，是在既有的依賴Type IIs類的限制性內(nèi)切酶的方法的基礎(chǔ)上形成的。Ko等[6]報道了一個可用于多位點突變的方法，但這種方法需要凝膠電泳和DNA回收等步驟，很難在短時間內(nèi)完成，因此并不適合做為一般的實驗方法使用，尤其是那些需要對多個樣品進行突變的情況。本研究所提供的方法中，則完全避免了凝膠電泳和DNA回收等步驟，實驗程序簡單，而且可在短時間內(nèi)完成，也適用于同時處理多個樣品的情況。在本研究提供的實驗程序中，我們一般會在實驗的前一天，做第一步的PCR反應(yīng)，這樣，在次日正式開始實驗時，就可以進行后續(xù)的酶切和純化步驟，后面的實驗步驟就可以于一天內(nèi)完成。為了驗證實驗程序的有效性，我們在nm23-EGFP融合基因中，分別引入了三個或者四個位點的突變，實驗結(jié)果都獲得了接近100%的突變率。本研究所提供的方法，為基因結(jié)構(gòu)和功能的研究提供了一個有用的工具。