馬晴 王競 鐘殿勝 寧超 劉暢 肖平

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）是一種跨膜受體酪氨酸激酶，屬于HER家族的一員。研究[1]發(fā)現(xiàn)，EGFR在50%-90%的非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者中高表達(dá)，參與腫瘤的血管新生、遷移和粘附過程，其擴(kuò)增和突變已被認(rèn)為是肺部腫瘤發(fā)生的主要機(jī)制之一。研究[2-4]表明，EGFR基因突變狀態(tài)是決定EGFR酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor, TKI）療效最重要的預(yù)測因子。目前，已經(jīng)報(bào)道的EGFR基因突變類型大約有60種[1]，包括外顯子19的缺失、外顯子18和21的單核苷酸的替換突變及20外顯子的復(fù)制突變，其中外顯子21的L858R和外顯子19的缺失突變占突變的絕大多數(shù)，可達(dá)89%以上。

美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network, NCCN）NSCLC指南中明確指出，對于IV期非鱗NSCLC患者，應(yīng)先行EGFR基因突變檢測，如果存在EGFR基因突變，治療上優(yōu)先推薦EGFR-TKI。

目前EGFR突變檢測方法較多，現(xiàn)有臨床應(yīng)用的方法中，直接測序法和ARMS法應(yīng)用較廣。DNA直接測序法，作為EGFR突變檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，可以檢測所有的突變分析的區(qū)域，但其靈敏度較低，樣本要求高，只能對含量大于30%的突變基因進(jìn)行檢測。ARMS法敏感，流程速度快、簡單，數(shù)據(jù)分析要求低，但僅能檢測已知突變，且試劑費(fèi)用昂貴，臨床中推廣有一定困難。2009年Yu等[5]首次制備出了2種最常見的EGFR突變的特異性單克隆抗體——抗E746-A750缺失突變抗體和抗L858R點(diǎn)突變抗體，并應(yīng)用于福爾馬林固定、石蠟包埋組織的免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry, IHC）檢測。IHC作為常規(guī)病理檢查手段，具有標(biāo)本處理方法簡單、快速，價(jià)格便宜，且可以在臨床病理科進(jìn)行。近年來多項(xiàng)臨床獨(dú)立研究[6-15]應(yīng)用特異性抗體檢測NSCLC患者EGFR突變檢測與直接測序法比較，其敏感度44%-100%，特異度85%-99%。本文通過meta分析判定IHC法診斷準(zhǔn)確度及臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 檢索策略 計(jì)算機(jī)檢索Pubmed、中國醫(yī)院知識倉庫醫(yī)學(xué)專題全文數(shù)據(jù)庫（CNKI）、中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫（CBM disc）和萬方數(shù)據(jù)庫。檢索時(shí)間：2009年1月-2013年2月。收集國內(nèi)外公開發(fā)表的“關(guān)于特異性抗體免疫組化法檢測EGFR突變價(jià)值”的文章。中文檢索詞為表皮生長因子受體突變、L858R點(diǎn)突變、抗體、E746-A750缺失突變、免疫組織化學(xué)法、非小細(xì)胞肺癌。英文檢索詞：epidermal growth factor receptor、EGFR、non-small cell lung cancer、NSCLC、E746-A750 deletion mutantion、immunohistochemical method、L858R point mutation。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 研究類型：使用EGFR突變特異性抗體L858R及E746-750del檢測外顯子21及外顯子19突變情況，同時(shí)應(yīng)用檢測金標(biāo)準(zhǔn)DNA直接測序法比較其敏感度特異度的文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)：①研究類型為含有EGFR突變特異性抗體L858R及E746-A750del檢測對NSCLC患者EGFR突變檢測價(jià)值的前瞻性或回顧性研究；②研究對象采用DNA直接測序?yàn)榻饦?biāo)準(zhǔn)，文獻(xiàn)需明確說明受試者病理類型；③文章提供了特異性抗體免疫組化檢測在各病例組的真陽性（true positive, TP）、真陰性（true negative, TN）、假陽性（false positive, FP）、假陰性（false negative, FN）例數(shù)或通過文章提供的數(shù)據(jù)可以計(jì)算；④每組病例數(shù)均＞20；⑤文獻(xiàn)中EGFR突變檢測采用統(tǒng)一可評價(jià)的IHC方法及標(biāo)準(zhǔn)（IHC陽性定義：10%以上腫瘤細(xì)胞胞膜染色定義為陽性，DNA直接測序標(biāo)本均來源于NSCLC患者的FFPE標(biāo)本）。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①IHC與其他檢測方法（如ARMS法）比較，而無直接測序法對照的文獻(xiàn)，主要因?yàn)锳RMS法雖為常用臨床檢查方法，敏感度特異度高但僅能檢測已知突變，對于IHC法陽性預(yù)測值（positive predictive value,PPV）和陰性預(yù)測值（negative predictive value, NPV）統(tǒng)計(jì)有一定影響；②采用除以上兩種特異性抗體進(jìn)行免疫組化的檢測；③EGFR免疫組化無統(tǒng)一判定標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)；④重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，發(fā)表較早或樣本量較小的文獻(xiàn)排除。

1.3 數(shù)據(jù)提取 所有納入研究均提取以下內(nèi)容：①研究人群基本情況；②各個研究的對于特異性抗體免疫組化法檢測EGFR突變篩檢試驗(yàn)的真陽性、真陰性、假陽性和假陰性，由2名作者按照上述標(biāo)準(zhǔn)獨(dú)立納入文獻(xiàn)和提取資料，而后交叉核對，意見不一致時(shí)通過討論解決。

1.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 整理原始文獻(xiàn)并摘錄數(shù)據(jù)，由2名作者獨(dú)立輸入數(shù)據(jù)，用meta-Disc 1.4進(jìn)行分析。用各研究精確估計(jì)量在受試者工作特征（receiver operator characteristic curve, ROC）曲線平面所形成的圖像是否呈典型“肩臂”狀分布進(jìn)行各研究間由閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性分析；用q檢驗(yàn)（inverse variance chi-squared test）進(jìn)行異質(zhì)性檢驗(yàn)，如果同質(zhì)性好（P≥0.05, I2≤25%），采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行數(shù)據(jù)合并；若存在異質(zhì)性（P＜0.05,I2＞25%）采用隨機(jī)效應(yīng)模型分析。對比特異性抗體免疫組化方法與DNA直接測序法比較的敏感度、特異度，評判該方法的準(zhǔn)確性。對各研究的原始數(shù)據(jù)（真陽性、假陽性、真陰性及假陰性的例數(shù)）進(jìn)行整合，分別計(jì)算L858R及E746-A750del特異性抗體免疫組化的平均敏感度、特異度、比值比及各自的95%可信區(qū)間（confidence interval, CI）。采用Mose’s constant線性模型擬合SROC曲線，以診斷比值比（diagnositic odds ratio, DOR）、曲線下面積（aera under curve, AUC）和Q統(tǒng)計(jì)量評價(jià)免疫組化法對NSCLC患者EGFR突變診斷的準(zhǔn)確度。以納入meta分析的各研究的敏感度為Y軸，以（1-特異度）為X軸繪制SROC曲線，直觀上評估診斷試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，曲線越靠近左上角，曲線下面積越大，其診斷準(zhǔn)確性越高。按照α=0.05的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)判斷。

2 結(jié)果

2.1 檢索結(jié)果及納入研究文獻(xiàn) 通過設(shè)定的檢索詞進(jìn)行初步檢索，共找到88篇文獻(xiàn)。閱讀文題和摘要排除62篇，初步納入文獻(xiàn)26篇。進(jìn)一步閱讀全文，排除未達(dá)到納入標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)12篇，重復(fù)文獻(xiàn)2篇，無法獲得所需全部原始數(shù)據(jù)的文獻(xiàn)2篇，最終納入文獻(xiàn)共10篇，如圖1所示，其中2篇僅涉及L858R抗體，未涉及E746-A750del抗體的免疫組化。

圖 1 文獻(xiàn)篩選流程圖Fig 1 Flow chart for study selection

2.2 納入研究的基本特征 本文共納入10項(xiàng)研究，E746-A750del免疫組化累計(jì)病例1,679例，L858R免疫組化累計(jì)病例1,041例，各研究免疫組化法例數(shù)、敏感度及特異度參見表1。

2.3 納入研究的方法學(xué)質(zhì)量評價(jià)，結(jié)果見表2。

2.4 Meta分析結(jié)果

2.4.1 異質(zhì)性檢驗(yàn) 以DOR作為效應(yīng)量，分別分析L858R、E746-A750del免疫組化與直接測序的異質(zhì)性，Q檢驗(yàn)顯示Cochran-Q分別為20.31和5.64，P＜0.05，P＞0.05，I2分別為65.5%和0%，L858R抗體免疫組化研究間存在異質(zhì)性，故以下分析選用隨機(jī)效應(yīng)模型。E746-A750del免疫組化采用固定效應(yīng)模型。

2.4.2 Meta分析 隨機(jī)效應(yīng)模型meta分析結(jié)果顯示：應(yīng)用特異性抗體免疫組化方法的合并敏感度、特異度、陽性似然比（positive likelihood ratio, PLR）、陰性似然比（negative likelihood ratio, NLR）和DOR比分別如圖2-圖6所示。

圖2所示為E746-A750del和L858R對NSCLC診斷敏感度的森林圖。E746-A750del鑒別NSCLC患者EGFR突變的平均敏感度為0.90（95%CI: 0.84-0.94, P=0.656,5 ），L858R的平均敏感度為0.65（95%CI: 0.59-0.70, P＜0.001）。

圖3所示為E746-A750del和L858R對EGFR突變診斷特異度的森林圖。E746-A750del鑒別EGFR突變的平均特異度為0.95（95%CI: 0.93-0.97, P＜0.001），L858R的平均特異度為0.99（95%CI: 0.98-0.99, P=0.001,6）。

圖4所示為E746-A750del和L858R診斷EGFR突變的PLR分別為25.23（95%CI: 6.74-94.44, P＜0.001）和44.69（95%CI: 19.57-102.06, P=0.011,2）。

圖5所示為E746-A750del和L858R診斷EGFR突變的NLR分別為0.13（95%CI: 0.09-0.20, P=0.770,5）和0.21（95%CI: 0.12-0.39, P＜0.001）。

圖6所示為E746-A750del和L858R診斷EGFR突變的DOR分別為225.17（95%CI: 55.67-910.69, P=0.004,9）和267.16（95%CI: 132.45-538.88, P=0.775,6）。

圖 2 E746-A750del（A）和L858R（B）敏感度森林圖Fig 2 The forest plots of E746-A750del (A) and L858R (B) sensitivity

表 2 納入研究的方法學(xué)質(zhì)量評價(jià)Tab 2 Methodological quality assessment of included studies

2.4.3 SROC曲線 由E746-A750del和L858R的SROC曲線，計(jì)算靈敏度對數(shù)與（1-特異度）對數(shù)的Spearman相關(guān)系數(shù)ρ，E746-A750del和L858R的P值分別為-0.500和0.382，P均＞0.05，提示不存在閾值效應(yīng)。SROC AUC兩種檢驗(yàn)方法分別為94.84%和98.13%，Q值為0.888,3、0.939,7（圖7）。將每個研究逐一排除后行敏感性分析，結(jié)果顯示匯總靈敏度和特異度無明顯改變，提示meta分析結(jié)果的穩(wěn)定性較好。

圖 3 E746-A750del（A）和L858R（B）特異度森林圖Fig 3 The forest plot of E746-A750del (A)and L858R (B) specificity

圖 4 E746-A750del（A）和L858R（B）PLR森林圖Fig 4 The forest plot of E746-A750del(A) and L858R (B) PLR. PLR: positive likelihood ratio.

圖 5 E746-A750del（A）和L858R（B）NLP森林圖Fig 5 The forest plot of E746-A750del(A) and L858R (B) NLP. NLR: negative likelihood ratio.

圖 6 E746-A750del（A）和L858R（B）DOR森林圖Fig 6 The forest plot of E746-A750del (A) and L858R (B) DOR. DOR:diagnostic odds ratio.

綜上所述，E746-A750del和L858R特異性抗體免疫組化法鑒別EGFR突變，方法可靠，特異度高，靈敏度較高，IHC方法作為篩查突變方法可行性高，具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

圖 7 E746-A750del（A）和L858R（B）的SROC曲線Fig 7 The SROC curve of E746-A750del (A) and L858R (B)

3 討論

本文對納入的10項(xiàng)研究進(jìn)行meta分析，通過合并診斷效應(yīng)量、擬合SROC曲線比較L858R、E746-A750del特異性抗體免疫組化與直接測序法比較對EGFR突變的診斷效能。結(jié)果顯示E746-A750del鑒別NSCLC患者EGFR突變的平均敏感度為0.90（95%CI: 0.84-0.94），平均特異度為0.95（95%CI: 0.93-0.97）； L858R的平均敏感度為0.65（95%CI: 0.69-0.70），平均特異度為0.99（95%CI:0.98-0.99）。兩者結(jié)果綜合顯示特異性較高而敏感性稍差，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，考慮敏感度差別主要源于該方法僅能檢測已知最常見E746-A750del和L858R突變，而不能檢測其他EGFR基因突變，如9 bp、12 bp、18 bp、21 bp和24 bp缺失或L861Q替代等。Dahabreh等[15]的一項(xiàng)meta分析報(bào)告顯示，東亞人群中預(yù)測的特異性和敏感性分別為81%和81%。本研究結(jié)論與相關(guān)文獻(xiàn)相符。

一般認(rèn)為，PLR＞10或NLR＜0.1，基本可以確定或排除診斷。本研究得出的E746-A750del和L858R診斷EGFR突變的PLR分別為25.23（95%CI: 6.74-94.44）和44.69（95%CI: 19.57-102.6），提示兩者陽性均可以輔助臨床醫(yī)師做出相應(yīng)判斷，具有臨床應(yīng)用價(jià)值。但E746-A750del和L858R的NLR分別為0.13（95%CI: 0.09-0.20）和0.21（95%CI: 0.12-0.39），提示二者陰性時(shí)不能排除EGFR突變的可能。

DOR反映診斷試驗(yàn)的結(jié)果與疾病的聯(lián)系程度。取值＞1時(shí)，其值越大說明該診斷試驗(yàn)的判別效果較好；取值＜1時(shí)，正常人比患者更有可能被診斷試驗(yàn)判為陽性；取值=1時(shí)，表示該診斷試驗(yàn)無法判別正常人與患者。本研究中E746-A750del和L858R診斷EGFR突變的DOR分別為225.17（95%CI: 55.67-910.69）和267.16（95%CI:132.45-538.88），提示診斷試驗(yàn)的判斷效果好。

本文通過對可提供四格表數(shù)據(jù)的10篇文獻(xiàn)，計(jì)算合并敏感度、特異度、PLR、NLR、DOR，行異質(zhì)性分析后繪制SROC曲線，SROC曲線又名綜合受試者工作特征曲線，不受異質(zhì)性影響，可綜合靈敏度與特異度信息，綜合評價(jià)診斷試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，曲線以靈敏度為縱軸，以1-特異度為橫軸，原理為通過TRP、FRP進(jìn)行Logit變換將TRP與FRO間非線性關(guān)系轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N線性關(guān)系，利用最小乘法進(jìn)行參數(shù)統(tǒng)計(jì)，建立SPOC曲線回歸方程并獲得評價(jià)診斷試驗(yàn)準(zhǔn)確度的統(tǒng)計(jì)量。分析本文SROC曲線顯示，L858R和E746-A750DEL的AUC分別為0.948,4和0.981,3，Q*統(tǒng)計(jì)量分別為0.888,32和0.939,7，曲線靠近左上角，曲線下面積大，說明以上兩種特異性抗體IHC鑒別EGFR突變的準(zhǔn)確度均較高。本文納入的研究間存在異質(zhì)性，經(jīng)Spearman相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)，異質(zhì)性與閾值效應(yīng)無關(guān)，仍需做進(jìn)一步做meta回歸，尋找異質(zhì)性的可能來源。

本次meta分析的局限性：①meta分析的局限性：檢索到的文獻(xiàn)不夠全面。檢索范圍局限在已經(jīng)發(fā)表的研究，對于未公開發(fā)表的研究，如會議論文無法獲取，可能漏檢一些灰色文獻(xiàn)；檢索語種局限于中文和英文，可能會漏檢其它語種的相關(guān)研究；②納入研究的局限性：特異性抗體IHC作為診斷性試驗(yàn)，采用盲法檢測和盲法判斷可盡量減少診斷的傾向性，而多數(shù)研究未報(bào)告是否采用盲法檢測，存在測量偏倚的可能性。

綜上所述，目前的IHC可以檢測EGFR最常見外顯子19缺失和21外顯子L858R點(diǎn)突變這兩種突變，其靈敏度與特異性與直接測序法比較無明顯差別，且簡單易行，具有一定臨床應(yīng)用價(jià)值，有望成為NSCLC患者EGFR突變檢測的常規(guī)程序。