劉春遠(yuǎn) 趙豹猛 蔣宏 崔云福

結(jié)直腸癌是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于胃癌，位居第二位。近年來(lái)隨著飲食結(jié)構(gòu)的改變、人口老齡化以及查體重要性的逐步認(rèn)可，結(jié)腸癌發(fā)病率近年來(lái)有日益增高的趨勢(shì)?；ㄇ嗨厥且活?lèi)多酚類(lèi)化合物，廣泛存在于各種瓜果蔬菜中，其水溶性好，生物利用度高，是目前為止所發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的抗氧化劑和自由基清除劑，研究證明藍(lán)莓花青素在防治多種疾病尤其是心腦血管疾病方面效果非常顯著。近年來(lái)其抗腫瘤作用日益受到廣大學(xué)者的重視，例如對(duì)胃癌、口腔癌、肺癌等腫瘤的作用明顯。然而藍(lán)莓價(jià)格昂貴不適合普遍推廣，黑米中也含有豐富的花青素，而且我國(guó)是生產(chǎn)黑米最多的國(guó)家，這無(wú)疑為廣泛推廣創(chuàng)造了便利條件。但黑米花青素對(duì)腫瘤的抑制作用尤其是對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用尚缺乏相關(guān)研究。

材料與方法

一、一般資料

SW480結(jié)腸癌細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞研究所；黑米花青素購(gòu)自中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購(gòu)中國(guó)杭州四季青公司。

二、方法

1.細(xì)胞增殖抑制分析：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW480細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24小時(shí)，棄去原液，分別加入濃度0 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml、150 μg/ml、200 μg/ml含黑米花青素的RPMI-1640培養(yǎng)液，各濃度均設(shè)5個(gè)復(fù)組，用MTT法分別觀察作用12h、24h、36h、48h和60h后，各組細(xì)胞增殖情況。細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算公式如下：細(xì)胞抑制率(%)=(OD空白組—OD實(shí)驗(yàn)組)/OD空白組×100%。

2.細(xì)胞周期分析和凋亡檢測(cè)：方法同細(xì)胞增殖抑制分析，分別于12h、24h、36h、48h和60h，經(jīng)胰酶消化、70%乙醇固定，含碘化丙啶(PI)和R-Nase的PBS重懸細(xì)胞，用美國(guó)Coulter公司EPICS?倕XL流式細(xì)胞儀(FCM)進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)和凋亡檢測(cè)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，同一濃度黑米花青素不同作用時(shí)間的細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞周期分布百分比以及細(xì)胞凋亡率的比較采用直線相關(guān)(Pearson)分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；不同濃度黑花青素相同時(shí)間的細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞周期分布百分比以及細(xì)胞凋亡率的比較均采用樣本率差別的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、黑米花青素對(duì)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響

MTT結(jié)果顯示黑米花青素對(duì)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，而且抑制作用有著明顯的濃度依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性。兩者呈高度直線相關(guān)關(guān)系，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖1)

二、黑米花青素對(duì)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞周期的影響

流式分析結(jié)果顯示黑米花青素可以使G2/M期細(xì)胞增多，同一濃度不同時(shí)間的G1/S期細(xì)胞隨著與黑米花青素作用時(shí)間的延長(zhǎng)逐步減少，G2/M期細(xì)胞相應(yīng)逐步增多；不同濃度同一作用時(shí)間的細(xì)胞周期分布也不同，G2/M期細(xì)胞隨著黑米花青素濃度的增加而增加(圖1，表1)。不同濃度組48h細(xì)胞周期分布情況見(jiàn)圖2～6。

圖1 黑米花青素不同作用時(shí)間對(duì)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞增殖抑制率曲線圖

統(tǒng)計(jì)分析表明同一時(shí)間不同濃度組織間細(xì)胞周期構(gòu)成比差異具有顯著性、同一濃度不同時(shí)間點(diǎn)之間細(xì)胞構(gòu)成呈直線相關(guān)關(guān)系，(P<0.01)。

表1 不同濃度黑米花青素組細(xì)胞周期百分率表

圖2 0μg/ml黑米花青素的RPMI-1640培養(yǎng)液組48h細(xì)胞周期分布直方圖，與其他時(shí)間作用時(shí)間相比G2/M期細(xì)胞所占比率無(wú)明顯變化，其比率為9.4%；圖3 50μg/ml黑米花青素的RPMI-1640培養(yǎng)液組48h細(xì)胞周期分布直方圖，G2/M期細(xì)胞所占比率隨作用時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增高，其比率為30.0%；圖4 100μg/m黑米花青素的RPMI-1640培養(yǎng)液l組48h細(xì)胞周期分布直方圖，G2/M期細(xì)胞所占比率隨作用時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增高，其比率為44.3%；圖5 150μg/ml黑米花青素的RPMI-1640培養(yǎng)液組48h細(xì)胞周期分布直方圖，G2/M期細(xì)胞所占比率隨作用時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增高，其比率為49.5%；圖6 200μg/ml黑米花青素的RPMI-1640培養(yǎng)液黑組48h細(xì)胞周期分布直方圖，G2/M期細(xì)胞所占比率隨作用時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增高，其比率為54.0%

三、黑米花青素對(duì)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響

SW480結(jié)腸癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡情況詳見(jiàn)表2結(jié)果表明細(xì)胞凋亡率隨著黑米花青素濃度和作用時(shí)間的增加而升高。與0μg/ml濃度組相比，其他各組細(xì)胞凋亡率均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但當(dāng)黑米花青素濃度增加到一定程度(150μg/ml)后，細(xì)胞凋亡率增加不再明顯。不同黑米花青素組48h細(xì)胞凋亡情況見(jiàn)圖7～11，M1亞峰為細(xì)胞凋亡峰。

表2 不同濃度黑米花青素組SW480，結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡情況表

注：FL3-H為PE-TR熒光素通道

討 論

結(jié)腸癌是一種嚴(yán)重威脅人民群眾健康的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于胃癌，位居消化道惡性腫瘤第二位[1]。近年來(lái)由于生活條件的改善、飲食結(jié)構(gòu)的改變、人口老齡化以及查體重要性的逐步認(rèn)可，結(jié)腸癌的發(fā)病率有日益增高的趨勢(shì)。疾病的治療重在預(yù)防，惡性腫瘤更不例外，到目前為止只有少數(shù)惡性腫瘤可以得到永久治愈，大多數(shù)患者終將在數(shù)月到數(shù)年內(nèi)死亡。因此如何預(yù)防腫瘤的發(fā)生顯得尤為重要。任何惡性腫瘤的發(fā)生都是一個(gè)逐步漸進(jìn)發(fā)生的過(guò)程，只要進(jìn)行有效干預(yù)，它的發(fā)展可能就會(huì)終止、甚至消失；反之惡性腫瘤終將形成并威脅人類(lèi)生命健康。有研究顯示，纖維結(jié)腸鏡檢查發(fā)現(xiàn)60歲以上人群中，結(jié)腸息肉檢出率高達(dá)50%[2]，而結(jié)腸息肉如不加控制就可能演變成結(jié)腸癌，但由于國(guó)情所限，大多數(shù)國(guó)人無(wú)法定期體檢，大多數(shù)患者就診時(shí)已經(jīng)到疾病晚期。

花青素是一類(lèi)多酚化合物，廣泛存在于各種瓜果蔬菜中，其水溶性好，生物利用度高，是目前為止所發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)抗氧化劑和自由基清除劑，研究證明藍(lán)莓花青素在防治多種疾病尤其是心腦血管疾病方面效果顯著[3-4]。近年來(lái)其抗腫瘤作用日益受到廣大學(xué)者的重視[5-8]，然而藍(lán)莓價(jià)格昂貴鑒于我國(guó)實(shí)際不適合普遍推廣。我國(guó)是世界上黑米產(chǎn)量最多的國(guó)家，同時(shí)黑米中花青素含量豐富，這無(wú)疑為廣泛推廣創(chuàng)造了便利條件。但黑米花青素對(duì)腫瘤的抑制作用尤其是對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用尚缺乏相關(guān)研究。

結(jié)腸癌和其它腫瘤一樣，從本質(zhì)上講都是細(xì)胞周期調(diào)控失調(diào)的結(jié)果。正常情況下細(xì)胞的增殖和凋亡處于一種平衡狀態(tài)，一旦平衡被打破，就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控、細(xì)胞凋亡程序無(wú)法啟動(dòng)，并最終到導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生。本研究通過(guò)黑米花青素對(duì)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞在細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期三方面的影響，來(lái)闡述黑米花青素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的作用。細(xì)胞增殖影響結(jié)果顯示：黑米花青素對(duì)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，而且這種抑制作用隨著黑米花青素濃度的升高而增高、隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，有明顯的濃度依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性。這一結(jié)果與其他研究結(jié)果基本一致[9-10]，但其他學(xué)者只是觀察到不同濃度花青素對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，而對(duì)于同一濃度花青素不同作用時(shí)間是否有差異未進(jìn)行觀察。本實(shí)驗(yàn)證明SW480結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖率可以明顯黑米花青素所抑制，這種抑制作用與花青素濃度和作用時(shí)間成直線正相關(guān)關(guān)系。

細(xì)胞周期(cell cycle)是細(xì)胞生命活動(dòng)的基本過(guò)程，指從細(xì)胞分裂結(jié)束開(kāi)始，到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束為止的過(guò)程。典型的細(xì)胞周期可以分為四個(gè)時(shí)相，分別是：G1期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)、G2期(DNA合成后期)和M期(有絲分裂期)，此外靜止期細(xì)胞還包含G0期(休眠期)。任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)阻滯，細(xì)胞周期就不能順序進(jìn)行，進(jìn)而無(wú)法完成細(xì)胞分裂和增殖[11-12]。流式細(xì)胞儀對(duì)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)表明，黑米花青素可以阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)行并促使結(jié)腸癌細(xì)胞啟動(dòng)凋亡程序引起細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)黑米花青素可以將SW480結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。但本研究發(fā)現(xiàn)黑米花青素對(duì)細(xì)胞凋亡的影響雖然也呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性，但與細(xì)胞增殖抑制不同，當(dāng)黑米花青素濃度達(dá)到一定值時(shí)，濃度的增加對(duì)凋亡率的影響逐漸減小。本研究發(fā)現(xiàn)濃度在200 μg/ml時(shí)雖然較150μg/ml時(shí)細(xì)胞凋亡率有所增加，但增加幅度并像細(xì)胞增殖抑制那樣明顯，作者認(rèn)為這可能與黑米花青素影響SW480結(jié)腸癌細(xì)胞著壁有關(guān)，本研究觀察到當(dāng)黑米花青素濃度升高到一定程度，細(xì)胞著壁率是有所下降的。

本研究提示黑米花青素可能對(duì)人類(lèi)抗擊結(jié)腸癌細(xì)胞的戰(zhàn)斗中發(fā)揮不可小覷的重要作用，但體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜多變，其效果如何，尚需進(jìn)一步研究。

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