陳峻崧，楊 潔，邵家勝，洪曉武

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，江蘇 南京 210009；2.江蘇先聲藥業(yè)有限公司,江蘇 南京 210042；3.上海復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心 內(nèi)科學(xué)系，上海 201508；4.復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)系，上海 200032)

卵巢癌是發(fā)病率第3位的女性生殖器惡性腫瘤，占女性惡性腫瘤的5%。但因卵巢癌致死者，卻占各類婦科腫瘤的首位[1-2]；中國(guó)女性的卵巢癌發(fā)病率為3.8/10萬(wàn)，每年有1.2萬(wàn)人死于卵巢癌[3]。卵巢癌復(fù)發(fā)率高，五年生存率僅有15%～30%，主要原因是耐藥而導(dǎo)致的復(fù)發(fā)[2，4]。卵巢癌干細(xì)胞(Ovarian Cancer Stem cells,OCSCs)常被描述為與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、抗輻射、耐藥和復(fù)發(fā)密切相關(guān)的腫瘤細(xì)胞[5-6]，含量極低。OCSCs作為卵巢癌治療中的重要靶細(xì)胞，OCSCs生物學(xué)特性的研究日益增多，在人上皮卵巢癌(Human Epithelial ovarian cancer,EOC)中分離的一部分表型為CD44+CD117+的細(xì)胞，被證實(shí)具有更高的順鉑和紫杉醇耐受性和在裸鼠中具有高致瘤性[7]。但是針對(duì)OCSCs的靶向抗腫瘤藥物仍未被開(kāi)發(fā)出，因此，深入了解OCSCs的耐藥機(jī)制，尋找靶向消滅OCSCs的藥物是治愈卵巢癌的關(guān)鍵。

1 資料與方法

1.1 人OCSCs分選收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人EOC HO8910細(xì)胞 用免疫磁珠分選(magnetic-activated cell sorting,MACS)Buffer(MACS- Runnning Buffer:PBS pH 7.2 + 2 mM EDTA +0.5% BSA)重懸細(xì)胞，白細(xì)胞計(jì)數(shù)板鏡下計(jì)數(shù)，每107個(gè)細(xì)胞重懸于80 μL Buffer中；CD44磁珠抗體標(biāo)記，每107個(gè)細(xì)胞加入20 μL的CD44磁珠單抗，混勻后4 ℃冰箱中孵育15 min；采用LS Columns柱，正性分選，過(guò)柱收集CD44+細(xì)胞后計(jì)數(shù)。再加入100 μLCD117磁珠單抗，混勻后在4 ℃冰箱中孵育45 min，再次過(guò)柱收集CD44+CD117+細(xì)胞，計(jì)數(shù)、放入培養(yǎng)瓶中，加入干細(xì)胞培養(yǎng)液，注意無(wú)菌操作。

1.2 人OCSCs的無(wú)血清培養(yǎng)與鑒定 CD44+CD117+細(xì)胞加入干細(xì)胞培養(yǎng)液在培養(yǎng)瓶中置37 °C、5%CO2飽和濕度條件下常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)。無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)液[7]為DMEM/F12培養(yǎng)基加入5 μg/mL牛胰島素，20 ng/mL人重組表皮生長(zhǎng)因子，10 ng/mL成纖維生長(zhǎng)因子和0.4%牛血清白蛋白配制而成；流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometer，F(xiàn)CM)檢測(cè)分選的EOC CD44+CD117+細(xì)胞表面CD44和CD117分子表達(dá)，每100 μL含待測(cè)細(xì)胞的反應(yīng)體系先后加入0.5 μg FITC 標(biāo)記的CD44+單克隆抗體[8]和5 μL PE標(biāo)記的CD117+單克隆抗體[9]，4 ℃孵育30 min；用PBS洗滌3次，每次3 min，重懸于400 μL PBS中；FCM檢測(cè)，設(shè)HO8910細(xì)胞為對(duì)照組，未加單抗的細(xì)胞為陰性對(duì)照。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐受性 選取處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的CD44+CD117+和HO8910細(xì)胞計(jì)數(shù)將細(xì)胞懸液接種于96孔板中，設(shè)3個(gè)復(fù)孔；在各細(xì)胞組中分別加入抗腫瘤藥物，具體濃度見(jiàn)表1。將已加入藥物的96孔板放入孵箱，在37 ℃、5%CO2及飽和濕度環(huán)境下，靜止培養(yǎng)72 h；加入5 mg/mL MTT 及SDS三聯(lián)液靜置12 h；酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)測(cè)各孔的吸光度值，以空白對(duì)照孔調(diào)零，記錄結(jié)果。

表1 5種抗腫瘤藥物的濃度(μM)及分組情況

藥物濃度組12345678910卡鉑12562.531.315.67.83.91.950.980.490.24紫杉醇62.531.315.67.83.92.00.980.490.240.12順鉑120072043225915693.35633.620.212.15-FU1000800400200100502512.56.253.125阿霉素10033.311.13.71.230.410.140.050.020.005

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(q-PCR)檢測(cè) 檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞HO8910及其OCSCs(表達(dá)CD44+CD117+)的ABCG2、ABCB1、Nanog、MMP-2和MMP-9及β-actin基因表達(dá)。各引物序列(見(jiàn)表2)，均由上海Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成，純度為PAGE級(jí)。使用TAKARA公司的PrimeScript?RT試劑盒，按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的操作步驟，進(jìn)行相關(guān)試劑的配比和實(shí)驗(yàn)，得到cDNA。以逆轉(zhuǎn)錄合成的樣品的cDNA產(chǎn)物作為模板，采用SYBR?GreenI20 μL反應(yīng)體系，配制PCR反應(yīng)液進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。以ddH2O為模板設(shè)陰性對(duì)照，電腦采集每個(gè)循環(huán)的ct值。比較各組間的差異有無(wú)顯著性，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，獲取平均值所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0分析軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，各組間差異采用方差分析(ANOVA)，多樣本均數(shù)之間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 ABCG2,ABCB1,Nanog,β-actin,MMP-2和MMP-9引物序列

基因Gene IDRT-PCR引物序列ABCG29429上游5’-GGCTTATACGGCCAGTTCCA-3’下游5’-GTCCGTTACATTGAATCCTGGAC-3’ABCB15243上游5’-CGAATGTCTGAGGACAAGCCAC-3’下游5’-CCATGAGGTCCTGGGCATG-3’Nanog71950上游5’-GGGCCTGAAGAAAACTATCCATCC-3’下游5’-TGCTATTCTTCGGCCAGTTGTTTT-3’β-actin69642上游5’-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3’下游5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’MMP-24313上游5’-CGTTTGATGGCAAGGATGGAC-3’下游5’-GCCATCAGCGTTCCCACTTTAC-3’MMP-981687上游5’-CGCTGGGCTTAGATCATTCC-3’下游5’-GTGCCGGATGCCATTCAC-3’

2 結(jié)果

2.1 分選的EOC細(xì)胞表面CD44+CD117+表達(dá)情況 細(xì)胞分選前(見(jiàn)圖1A)，HO8910細(xì)胞表面CD44和CD117皆為陽(yáng)性的CD44+CD117+細(xì)胞占1%±1.7%，而CD44和CD117皆為陰性的CD44-CD117-細(xì)胞占82.2%±3.7%；CD44+CD117-細(xì)胞占13.8%±2.1%，CD44-CD117+細(xì)胞占1.2%±0.6%。細(xì)胞分選后(見(jiàn)圖1B)，細(xì)胞表面CD44和CD117皆為陽(yáng)性的CD44+CD117+細(xì)胞占84.2%±9.4%，而CD44和CD117皆為陰性的CD44-CD117-細(xì)胞占2%±0.5%；CD44+CD117-細(xì)胞占15.1%±3.3%，CD44-CD117+細(xì)胞占0.4%±0.2%。表明經(jīng)過(guò)免疫磁珠分選后，原本僅占極少數(shù)的CD44+CD117+細(xì)胞1%±1.7%，獲得了富集，比例大大上升84.2%±9.4%，P<0.01。

注：A:為免疫磁珠分選前HO8910細(xì)胞；B:為免疫磁珠分選后CD44+CD117+細(xì)胞。圖1 EOCHO8910細(xì)胞免疫磁珠分選前后FCM檢測(cè)表達(dá)CD44+CD117+細(xì)胞比例

2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)變化 人EOCHO8910細(xì)胞株在無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 d，細(xì)胞呈鋪路石狀，貼壁生長(zhǎng)2 d后部分細(xì)胞脫落，懸浮于培養(yǎng)基中。7 d后，大部分細(xì)胞凋亡，大量的細(xì)胞碎片懸浮于培養(yǎng)基中(見(jiàn)圖2A-C)。HO8910CD44+CD117+細(xì)胞在無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后，仍能夠進(jìn)行擴(kuò)增，形成多個(gè)團(tuán)狀、腺泡狀結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖2D-F)。對(duì)照組HO8910細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中呈貼壁狀生長(zhǎng)(見(jiàn)圖2G-I)。

2.3 細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性 不同濃度的化療藥物作用下，各組細(xì)胞表現(xiàn)出劑量依賴性的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率越低表示該細(xì)胞的耐藥性就越強(qiáng)(見(jiàn)圖3)。在中濃度梯度區(qū)間CD44+CD117+細(xì)胞比HO8910細(xì)胞顯現(xiàn)出更強(qiáng)的耐藥性(P<0.05)。5-FU藥物組表現(xiàn)為：在高濃度梯度時(shí)(1～3用藥組)CD44+CD117+細(xì)胞與HO8910細(xì)胞耐藥性無(wú)差別(P>0.05)，而在中低濃度梯度區(qū)間(4～10用藥組)CD44+CD117+細(xì)胞明顯比HO8910細(xì)胞更為耐藥(P<0.05)?？ㄣK藥物組中，CD44+CD117+細(xì)胞和HO8910細(xì)胞呈現(xiàn)劑量正相關(guān)性的細(xì)胞抑制率曲線，即隨著藥物作用濃度的升高，兩組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率液逐漸升高。除最高劑量(125 μM)外，CD44+CD117+細(xì)胞比HO8910細(xì)胞顯現(xiàn)出更強(qiáng)的耐藥性(P<0.05)。順鉑和紫杉醇用藥組中兩細(xì)胞組表現(xiàn)類似的耐藥現(xiàn)象，即在高濃度梯度時(shí)(1～4用藥組)CD44+CD117+細(xì)胞與HO8910細(xì)胞耐藥性無(wú)差別(P>0.05)，細(xì)胞抑制率都達(dá)到80%以上；而在中濃度梯度區(qū)間(5～8用藥組)CD44+CD117+細(xì)胞明顯比HO8910細(xì)胞更為耐藥(P<0.05)。而低濃度梯度區(qū)間(9～10用藥組)，由于用藥濃度較低，表現(xiàn)為各組細(xì)胞都有較強(qiáng)的生存能力，抑制率較低，CD44+CD117+細(xì)胞與HO8910細(xì)胞耐藥能力無(wú)顯著差別(P>0.05)。阿霉素組中，在高中濃度梯度時(shí)(1～4用藥組)CD44+CD117+細(xì)胞與HO8910細(xì)胞耐藥性無(wú)差別(P>0.05)，都表現(xiàn)出較高的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(80%以上)。而在中低濃度梯度區(qū)間(5～10用藥組)CD44+CD117+細(xì)胞明顯比HO8910細(xì)胞更為耐藥(P<0.05)。

注：A-C為HO8910細(xì)胞在無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中，分別經(jīng)過(guò)1、2、7 d后的生長(zhǎng)情況；D-F為HO8910CD44+CD117+細(xì)胞在無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)1、2 和7 d后的生長(zhǎng)情況；G-I為HO8910細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)1、2、7 d后的生長(zhǎng)情況(A-H：放大倍數(shù)×100，I：放大倍數(shù)×400)。圖2 EOCHO8910細(xì)胞及其CD44+CD117+細(xì)胞體外培養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)

注：*P<0.05。圖3 HO8910細(xì)胞及其CD44+CD117+細(xì)胞對(duì)5種化療藥物不同濃度藥敏試驗(yàn)的結(jié)果

2.4 q-PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá) HO8910細(xì)胞及CD44+CD117+細(xì)胞經(jīng)過(guò)總RNA提取，進(jìn)行q-PCR對(duì)比研究。結(jié)果顯示(見(jiàn)圖4)CD44+CD117+細(xì)胞的ABCG2,ABCB1,Nanog,MMP-2和MMP-9基因mRNA表達(dá)水平都高于同樣培養(yǎng)條件下的HO8910細(xì)胞(P<0.05)，ABCG2基因mRNA表達(dá)水平，CD44+CD117+細(xì)胞是HO8910細(xì)胞11倍；與HO8910細(xì)胞相比，CD44+CD117+細(xì)胞ABCB1、Nanog、MMP-2和MMP-9基因mRNA表達(dá)水平分別是前者的7.6倍、2.5倍、5.5倍和6倍。

注：*P<0.05,**P<0.01。圖4 q-PCR檢測(cè)HO8910細(xì)胞及CD44+CD117+細(xì)胞的ABCG2,ABCB1,Nanog,MMP-2和MMP-9mRNA表達(dá)

2.5 腫瘤干細(xì)胞耐藥作用機(jī)制(見(jiàn)圖5)。

圖5 腫瘤干細(xì)胞耐藥作用機(jī)制及相關(guān)特征分子標(biāo)記

3 討論

研究顯示，卵巢癌復(fù)發(fā)率高，5年生存率僅有15%～30%[1]，主要原因可能是腫瘤干細(xì)胞引起的耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移所致[4]。因此，尋找靶向消滅腫瘤干細(xì)胞的藥物或提高其對(duì)化療藥物的敏感性是治愈卵巢癌的關(guān)鍵[10]。由于腫瘤干細(xì)胞僅占腫瘤細(xì)胞中的極少部分0.04%～0.2%[11]，較難獲得，因此，首先要獲得具有干細(xì)胞特性的一部分腫瘤細(xì)胞，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)、化療藥物耐藥實(shí)驗(yàn)，深入了解其耐藥作用機(jī)制，為腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)特征研究、靶向抗腫瘤藥物研發(fā)等奠定基礎(chǔ)。

干細(xì)胞因子受體(stem cell factor receptor，SCFR)，即CD117是一種跨膜的酪氨酸激酶受體，大小為145kD，在多種腫瘤中廣泛存在的癌蛋白[12]。在卵巢癌細(xì)胞中，CD117+的細(xì)胞比例非常低，在0.5%～3%[13]。Zhang等[7]報(bào)道，在人卵巢癌組織中分離出一部分高表達(dá)CD44和CD117的腫瘤細(xì)胞，在體外培養(yǎng)形成獨(dú)立的、具有自我更新能力的細(xì)胞球。這些CD44+CD117+細(xì)胞具有高致瘤性和體內(nèi)重建卵巢癌等特性，僅用100個(gè)CD44+CD117+細(xì)胞即可使裸鼠致瘤。CD44+CD117+細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞相關(guān)特征，可能是一種OCSCs。

目前腫瘤干細(xì)胞的分離方法通常通過(guò)細(xì)胞表面特異性標(biāo)志篩選[7]、無(wú)血清培養(yǎng)富集[14]、SP細(xì)胞分選等[15]。本實(shí)驗(yàn)利用免疫磁珠分選方法，以磁珠直接標(biāo)記的人CD44和CD117單克隆抗體，從人EOCHO8910細(xì)胞株中分選獲得了比例為84.1%±9.4%的CD44+CD117+細(xì)胞。進(jìn)而使用了目前臨床上治療卵巢癌的一線化療藥物，如紫杉醇、卡鉑、順鉑、5-FU等5種化療藥物，比較CD44+CD117+細(xì)胞和EOCHO8910細(xì)胞的耐藥性差異。結(jié)果顯示從HO8910細(xì)胞分離的CD44+CD117+細(xì)胞，對(duì)卡鉑、順鉑、紫杉醇和5-FU、阿霉素化療藥物的耐藥性也明顯強(qiáng)于HO8910細(xì)胞。說(shuō)明CD44+CD117+細(xì)胞除了具有腫瘤干細(xì)胞相關(guān)表型外，還具有較強(qiáng)的化療藥物耐藥性。卵巢癌一線化療方案疾病控制率長(zhǎng)可達(dá)到90%以上，但是腫瘤患者3年的復(fù)發(fā)率達(dá)到40%以上[1]。具有較強(qiáng)耐藥性的CD44+CD117+細(xì)胞未被化療藥物完全殺滅可能是導(dǎo)致卵巢癌復(fù)發(fā)的原因之一。因此，針對(duì)CD44+CD117+細(xì)胞等具有腫瘤干細(xì)胞樣特征的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行靶向治療和特異性殺傷，是治愈卵巢癌的關(guān)鍵。

腫瘤干細(xì)胞表現(xiàn)出耐藥性，可能是其表面或細(xì)胞外基質(zhì)高表達(dá)一些受體或蛋白相關(guān)，如ABCG2,ABCB1。而腫瘤干細(xì)胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移與Nanog,MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)密切相關(guān)(見(jiàn)圖5)。在q-PCR試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在同等培養(yǎng)條件下OCSCs中ABCG2、ABCB1、Nanog、MMP-2和MMP-9mRNA基因明顯高于HO8910細(xì)胞表達(dá)水平；已知ABCG2和ABCB1基因是一種ATP綁定的盒式轉(zhuǎn)運(yùn)體，能夠主動(dòng)將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的化療藥物和毒性物質(zhì)泵出胞外，從而避免細(xì)胞被殺傷。因此其高表達(dá)與腫瘤干細(xì)胞耐藥密切相關(guān)[16]。OCSCs中ABCG2和ABCB1基因表達(dá)升高，可能是其具有較高耐藥性的機(jī)制之一，研究具有靶向ABCG2和ABCB1分子的抗腫瘤藥物將可能是有效殺滅腫瘤干細(xì)胞的一個(gè)思路[17]。MMPs是一類鋅依賴的蛋白家族，是水解細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)的蛋白裂解酶，包括ECM及整合于質(zhì)膜中的各種膠原酶和彈性蛋白酶等，在腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用[18]。MMP-2和MMP-9作為MMPs蛋白家住中最為重要的成員，與腫瘤干細(xì)胞在體內(nèi)的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。OCSCS高表達(dá)MMP-2和MMP-9mRNA，也提示CD44+CD117+細(xì)胞可能具有高的侵襲性。Nanog基因主要與腫瘤干細(xì)胞保持未分化狀態(tài)有關(guān)[19]，在多種腫瘤干細(xì)胞中高表達(dá)[20]，CD44+CD117+EOC細(xì)胞高表達(dá)Nanog基因，提示該群細(xì)胞的低分化狀態(tài)，可能也是維持OCSCs未分化狀態(tài)和高增殖能力的重要轉(zhuǎn)錄因子和分子機(jī)制之一。如何提高OCSCs對(duì)化療藥物的敏感性，提高藥物的腫瘤干細(xì)胞殺傷效率，仍是需要不斷探索的重要課題，分子靶向治療是否在這一領(lǐng)域可發(fā)揮重要作用，還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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