程 龍，駱助林，向 珂，趙禮金

(1.成都軍區(qū)總醫(yī)院 全軍普通外科中心，四川 成都 610083；2. 遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 肝膽外科，貴州 遵義 563099)

膽管樹是一個不同管徑的、相互交通的三維網(wǎng)絡，從赫氏管向肝外肝膽管延伸。而被覆膽管的上皮細胞在發(fā)育上、結(jié)構(gòu)上、功能上是一個不均一的細胞群體[1- 2]。膽管細胞對膽汁中膽鹽重吸收的異質(zhì)性在膽管細胞生理及病理過程中具有重要意義[3]。膽管細胞膽鹽重吸收功能的異質(zhì)性決定于膽鹽轉(zhuǎn)運蛋白表達的差異。然而，目前尚無膽鹽轉(zhuǎn)運蛋白在大、小膽管中表達差異的對比研究。本研究重點檢測和分析頂側(cè)鈉依賴性膽汁酸轉(zhuǎn)運體(Apical sodium-dependent bile acid transporter, ASBT)、回腸膽汁酸結(jié)合蛋白(Ileum bile acid binding protein, IBABP)和基底側(cè)有機溶質(zhì)轉(zhuǎn)運體α(Organic solute transporter alpha OSTα)等膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白在大鼠不同節(jié)段膽管中的表達差異，為研究膽管細胞膽鹽重吸收異質(zhì)性在膽管疾病發(fā)生中的作用奠定理論和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8周齡雄性Spragure-Dawley(SD)大鼠，二級動物，體重200～250g，購于第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心。大鼠飼養(yǎng)于恒溫、清潔環(huán)境，維持12h晝夜節(jié)律，遵守實驗動物使用及管理原則。

1.2 大、小膽管的分離 參考我們前期研究中的肝內(nèi)膽管分離方法[4]。SD大鼠麻醉后(戊巴比妥，50 mg/kg)，取上腹部橫切口逐層進腹；22G留置針行門靜脈穿刺置管，用D-Hank’s持續(xù)灌注5min后，換用含0.05%IV型膠原酶的D-Hank’s液繼續(xù)灌注10 min；移出肝臟置于膽管細胞生長培養(yǎng)基中(含DMEM/F12=1∶1基礎培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清，100 U/L青-鏈雙抗，400 μg/L地塞米松，10 g/L胰島素，25 μg/L表皮生長因子)，鈍性分離以去除肝實質(zhì)及肝靜脈，剩余肝內(nèi)膽管樹部分；在手術顯微鏡下將膽管樹分為大膽管和小膽管兩部分組織，即以第三級膽管分支末端為界，近端為小膽管組織，遠端為大膽管組織(見圖1A～B)，膽管組織存于液氮中用于蛋白及RNA提取。

1.3 免疫組織化學檢測膽管細胞膽鹽轉(zhuǎn)運蛋白的表達 通過免疫組織化學法檢測大鼠肝膽管ASBT、IBABP及Ostα的表達。一抗分別為：ASBT, Santa cruz,1∶200；IBABP, Santa cruz, 1∶200； Ostα, Abcam, 1∶100。PBS液代替一抗作為陰性對照。選用SABC免疫組織化學檢測試劑盒進行染色，光學顯微鏡下分別觀察。

1.4 RNA提取和Real-time PCR檢測 采用RNAiso Plus提取總RNA，PrimscriptTMRT reagent Kit 逆轉(zhuǎn)錄，SYBR Premix Ex TaqTM Ⅲ試劑盒行Real-time PCR，引物序列和產(chǎn)物大小(見表1),由上海生工生物工程技術服務有限公司負責合成。反應條件及試劑均參照說明書進行。根據(jù)電泳結(jié)果確保所得產(chǎn)物，采用制作標準曲線的方法得到數(shù)據(jù)。

1.5 蛋白提取和Western blot檢測 膽管蛋白的提取參考既往文獻[4]。提取蛋白置于-80 ℃保存，應用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。每孔道上樣50 μg，8%SDS-PAGE凝膠電泳20 V，2h后80 V，3 h。200 mA轉(zhuǎn)膜2 h至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉過夜，室溫下孵育一抗(ASBT, 1∶500；IBABP, 1∶500； Ostα, 1∶1 000)、二抗2 h，應用發(fā)光試劑顯影及X膠片成像。掃描膠片后應用Quantity One軟件進行灰度測定。

注：A：大鼠膽管樹的實物圖：利用膠原酶灌注消化輔助機械分離方法獲得完整的膽管樹，完整的大鼠膽管系統(tǒng)包括:①尾狀葉,②右葉,③中葉,④左中葉, ⑤左外葉及⑥盤狀突的分支系統(tǒng)；B：大鼠大、小膽管分離的模式圖：在手術顯微鏡下，以三級膽管分支末端(虛線)為界將膽管組織分為兩部分，靠近肝門的部分主要含有大膽管，周圍的部分主要含較小膽管。 圖1 大、小膽管的分離方法

表1引物序列及產(chǎn)物大小

基因名稱引物溫度長度ASBT上游 5’-CAGTTTGGAATCATGCCTCTC-3’ 下游 5’-AAGGGGCATCATTCCAAGAGC-3’56℃207bpIBABP上游 5’-CTTCACCTGGTCCCAGTCT-3’下游 5’-CAACTTGTCACCCACGAC-3’55℃187bpOstα上游 5’-CCCTCATACTTACCAGGAAGAAGCTAC-3’下游 5’-CCATCAGGAATGAGAAACAGGC-3’58 ℃109bpβ-actin上游 5’-ATATCGCTGCGCTCGTCGTC-3’下游 5’-TCTTGCTCTGGGCCTCGTC-3’57℃174bp

2 結(jié)果

2.1 ASBT在正常大鼠膽管中的表達 免疫組織化學顯示ASBT表達于膽管上皮細胞頂側(cè)細胞膜，且主要表達于大膽管，隨著膽管直徑變小，其表達量也逐漸降低，至匯管區(qū)周圍小膽管幾乎無表達(見圖2A～B)。Real time PCR檢測結(jié)果顯示，大、小膽管組織中ASBT mRNA的相對表達量分別為0.59±0.10和0.26±0.07；Western blotting檢測結(jié)果顯示，大、小膽管組織中ASBT蛋白的相對表達量分別為0.84±0.21和0.49±0.18。統(tǒng)計分析表明，大膽管中ASBT的mRNA和蛋白表達水平均顯著高于小膽管(P<0.05，見圖2C～D) 。

注：A：免疫組織化學顯示ASBT表達于大膽管上皮細胞頂側(cè)細胞膜，IHC×400；B：隨著膽管直徑變小，ASBT其表達量也逐漸降低，至匯管區(qū)周圍小膽管幾乎無表達，IHC×400；C：Real time PCR結(jié)果顯示大膽管中ASBT的mRNA表達水平顯著高于小膽管；D：Western blotting結(jié)果也顯示大膽管中ASBT的蛋白表達水平顯著高于小膽管。 圖2 正常大鼠大、小膽管中ASBT的表達差異

2.2 IBABP在正常大鼠膽管中的表達 免疫組織化學顯示IBABP表達于膽管上皮細胞胞漿內(nèi)，主要表達于大膽管，隨著膽管直徑變小，其表達量也逐漸降低，至匯管區(qū)周圍小膽管幾乎無表達(見圖3A～B)。Real time PCR檢測結(jié)果顯示，大、小膽管組織中IBABP mRNA的相對表達量分別為0.66±0.12和0.20±0.06；Western blotting檢測結(jié)果顯示，大、小膽管組織中IBABP蛋白的相對表達量分別為0.56±0.11和0.17±0.08。統(tǒng)計分析表明，大膽管組織中IBABP的mRNA和蛋白表達水平均顯著高于小膽管(P<0.01，見圖3C～D)。

注：A：免疫組織化學顯示IBABP表達于大膽管上皮細胞的細胞漿內(nèi)，IHC×400；B：隨著膽管直徑變小，IBABP其表達量也逐漸降低，至匯管區(qū)周圍小膽管幾乎無表達，IHC×400；C：Real time PCR結(jié)果顯示大膽管中IBABP的mRNA表達水平顯著高于小膽管；D：Western blotting結(jié)果也顯示大膽管中ASBT的蛋白表達水平顯著高于小膽管。 圖3 正常大鼠大、小膽管中IBABP的表達差異

2.3 Ostα在正常大鼠膽管中的表達 免疫組織化學顯示Ostα表達于膽管上皮細胞基底側(cè)膜上，大、小膽管表達無顯著差異，且Ostα也表達與肝細胞血竇面(見圖4A～B)。Real time PCR檢測結(jié)果顯示，大、小膽管組織中Ostα mRNA的相對表達量分別為0.39±0.05和0.52±0.06；Western blotting檢測結(jié)果顯示，大、小膽管組織中Ostα蛋白的相對表達量分別為0.72±0.12和0.83±0.21。統(tǒng)計分析表明，大、小膽管組織中Ostα mRNA和蛋白的表達水平均無統(tǒng)計學意義(P<0.01，見圖4C～D)。

注：A：免疫組織化學顯示Ostα表達于大膽管上皮細胞基底側(cè)胞膜，IHC×400；B：Ostα在小膽管細胞中也有表達，主要位于膽管上皮細胞基底側(cè)胞膜，表達量與大膽管無統(tǒng)計學意義，IHC×400；C：Real time PCR結(jié)果顯示大、小膽管中Ostα的mRNA表達水平無統(tǒng)計學意義；D：Western blotting結(jié)果也顯示大、小膽管中Ostα的蛋白表達水平無統(tǒng)計學意義。 圖4 正常大鼠大、小膽管中Ostα的表達差異

3 討論

越來越多的研究證實膽管細胞在形態(tài)和功能上存在異質(zhì)性[1-2]。本研究著眼于膽管細胞膽鹽轉(zhuǎn)運及其相關蛋白表達的差異。膽管細胞頂側(cè)面暴露于高濃度的膽汁酸，膽管細胞與膽汁酸之間存在相互作用。膽管細胞頂側(cè)細胞膜表達一種鈉依賴性的膽汁酸轉(zhuǎn)運體(ASBT)，膽汁中膽汁酸可經(jīng)ASBT進入膽管細胞，在細胞內(nèi)與膽汁酸結(jié)合蛋白(IBABP)結(jié)合，從細胞膜頂側(cè)轉(zhuǎn)運至細胞基底側(cè)，經(jīng)細胞基底膜上的膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白將膽汁酸轉(zhuǎn)運入膽管周圍血管叢，從而進入門脈系統(tǒng)。經(jīng)膽管細胞單向性轉(zhuǎn)運入門脈系統(tǒng)的膽汁酸可經(jīng)肝細胞重新分泌入膽汁，形成膽汁酸的膽肝循環(huán)[5]。近來研究表明，膽肝循環(huán)可能在膽汁酸的肝膽轉(zhuǎn)運體系中具有重要作用，且參與了膽道梗阻引起的慢性膽汁淤積的適應性反應。膽汁酸從膽汁中轉(zhuǎn)運入膽管細胞是膽汁酸膽肝循環(huán)的重要始動環(huán)節(jié)。目前膽管細胞頂側(cè)膜表達的膽汁酸轉(zhuǎn)運體只有ASBT得到公認。細胞基底側(cè)的膽汁酸轉(zhuǎn)運可能由MRP3和Ostα-Ostβ異二聚體完成，而研究表明Ostα-Ostβ異二聚體起主要作用，而MRP3起輔助作用。有研究報道ASBT主要表達于大膽管細胞[6]，而IBABP和Ostα-Ostβ在膽管組織中的表達情況尚無明確研究報道。

本研究通過免疫組織化學檢測發(fā)現(xiàn)ASBT僅表達于直徑大于15μm的大膽管的上皮細胞頂側(cè)細胞膜上，而在直徑小于15μm的小膽管的上皮細胞無表達，這與以往研究報道一致。IBABP也只表達于大膽管上皮細胞的細胞漿內(nèi)，而不表達于小膽管細胞。與ASBT和IBABP不同，Ostα-Ostβ在大膽管和小膽管上皮細胞均表達，且都定位于膽管細胞基底側(cè)細胞膜，同時在肝細胞的血竇面也可見表達。Western blot檢測也顯示在三級分支末端之前的較大膽管組織中ASBT和IBABP的表達顯著高于其在三級分支末端之后的較小膽管組織的表達，而Ostα-Ostβ在兩者中表達無統(tǒng)計學意義。以上結(jié)果表明，盡管Ostα-Ostβ在大小膽管均有表達，而在膽肝循環(huán)中起始動作用的ASBT以及IBABP只表達于大膽管，所以膽管細胞對膽汁酸的重吸收也只能發(fā)生于大膽管。

由于進入膽管細胞的膽汁酸可發(fā)揮信號分子的作用，引起細胞內(nèi)Ca2+，PKC，PI3K，絲裂原激活蛋白(MAP)激酶和細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶等信號途徑的改變，顯著影響膽管細胞分泌功能，并在膽管細胞增生、凋亡及膽管周圍纖維化過程中起重要作用[7-8]。 所以膽汁酸在膽管細胞中轉(zhuǎn)運的平衡對維持膽管細胞正常生理功能和在免受膽汁酸毒性作用具有重要意義。在一些病理情況下，這種平衡可能會被破壞，引起膽管細胞的相應病理生理學改變，從而參與了膽管疾病的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果表明，膽汁酸重吸收可能只發(fā)生于大膽管，因此，膽汁酸轉(zhuǎn)運不平衡而引起膽鹽在細胞內(nèi)異常聚集可能也只發(fā)生于較大膽管上皮細胞，從而參與了主要累及較大膽管的膽管病的發(fā)生發(fā)展。肝移植后缺血型膽管病變是主要累及三級以上大膽管的彌漫性病變，且有研究顯示膽汁毒性在其發(fā)生發(fā)展中起重要作用[9-10]。且在我們前期研究中發(fā)現(xiàn)，肝移植后，膽管細胞膽鹽轉(zhuǎn)運蛋白表達呈現(xiàn)不平行的改變，且供肝冷缺血時間越長，這種不平行的程度越大，膽管損傷越重[4]。因此，我們推測，由于膽鹽轉(zhuǎn)運蛋白表達不平行導致了毒性膽鹽中細胞內(nèi)異常聚集而引起細胞損傷；而由于膽鹽轉(zhuǎn)運主要發(fā)生在大膽管，因此肝移植后缺血型膽管病主要發(fā)生在大膽管。然而，這一推測尚需要進一步深入研究證實。

綜上所述，由于ASBT和IBABP只表達于大膽管上皮細胞，Ostα同時表達于大膽管和小膽管上皮細胞，因此，膽管細胞對膽汁酸的重吸收主要發(fā)生于大膽管。研究膽管細胞膽鹽轉(zhuǎn)運的差異與膽管疾病發(fā)生的關系及分子基礎，不僅有助于闡明肝移植后缺血型膽管病的發(fā)生機制，而且也將為探索其他膽管疾病的發(fā)生發(fā)展機制提供新的思路。

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