岳 歡，李 燕，高 婧，江 濤，黃俊瓊

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科/遵義醫(yī)學(xué)院檢驗系，貴州 遵義 563099；2.四川省仁壽縣疾病預(yù)防控制中心，四川 眉山 620500)

趨化因子是一類小分子可溶性蛋白，能使免疫細胞發(fā)生定向趨化和遷移，在炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答中具有重要作用。哮喘疾病中炎性細胞的激活和浸潤，釋放趨化因子，調(diào)控其受體的表達，從而誘導(dǎo)炎性細胞遷移至支氣管粘膜下激活靶細胞釋放相關(guān)細胞因子，導(dǎo)致粘液分泌、氣道高反應(yīng)性等癥狀的發(fā)生。我們用SABioscience芯片，同時測定84個編碼趨化因子及其受體的關(guān)鍵基因在哮喘小鼠模型的表達情況，為進一步研究其功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 雞卵白蛋白 (Ovalbumin, OVA)(Sigma公司)；Trizol，SuperScript III Reverse Transcriptase(Invitrogen公司，美國)；無RNA酶的糖原(Ambion公司)；RNeasy?MinEluteTM純化試劑盒(Qiagen公司)；SABioscience趨化因子及其受體PCR芯片(PAMM-022Z，上?？党缮镉邢薰?。SPF級雌性C57BL/6小鼠,6～8周齡，體重18～22g,購于北京華阜康公司(SCXK(京)2009-0004)，飼養(yǎng)于遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心SPF級動物房。

1.2 方法

1.2.1 哮喘模型的建立 16只小鼠隨機分為哮喘組和對照組，每組8只。哮喘組在第1、7、14 d經(jīng)腹腔注射OVA+氫氧化鋁凝膠混懸液0.2 mL致敏，第21 d開始用5%OVA霧化激發(fā)，連續(xù)霧化7 d，每天30 min。對照組用PBS代替OVA。于末次霧化后24 h內(nèi)，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹動脈放血后取右肺組織，置于4%多聚甲醛中固定48 h，取左肺組織放于液氮中快速凍存提取總RNA。

1.2.2 肺組織HE染色 肺組織于4%多聚甲醛中固定48h后，取出進行脫水，石蠟包埋，肺組織切片，HE染色。在顯微鏡下觀察肺組織支氣管黏膜嗜酸性粒細胞、淋巴細胞等炎癥細胞的浸潤情況。

1.2.3 肺組織RNA提取 取小鼠肺組織50～100mg，加入1mLTrizol,按常規(guī)方法提取總RNA，用RNeasy?MinEluteTM純化試劑盒純化RNA，使用NanoDrop?ND-1000測定RNA濃度和純度。

1.2.4 cDNA合成和實時熒光定量PCR 用SuperScript III Reverse Transcriptase試劑盒進行RNA逆轉(zhuǎn)錄后，在105μLcDNA中加入2×SuperArray PCR master mix 1050 μL、945 μL滅菌雙蒸水，混勻，每孔PCR反應(yīng)管加入上述混勻液20 μL，進行2步法實時熒光定量PCR反應(yīng)：95 ℃10 min；95 ℃15 s；60 ℃1 min。數(shù)據(jù)分析通過2-ΔΔCt計算實驗組與對照組對應(yīng)基因的表達差異。

2 結(jié)果

2.1 哮喘小鼠模型建立 哮喘組小鼠于第1次激發(fā)后5～8 min出現(xiàn)煩躁不安，呼吸加深加快(180～200次/min)，霧化至15min表現(xiàn)為少動，點頭呼吸，口鼻發(fā)紺。對照組小鼠未出現(xiàn)上述表現(xiàn)。

2.2 肺組織HE色 對照組小鼠肺組織HE染色可見肺組織、支氣管完整，結(jié)構(gòu)正常，少見炎性細胞浸潤(見圖1A)。哮喘組小鼠肺組織支氣管黏膜上皮明顯增厚，氣道平滑肌增厚，氣道管腔變狹窄，氣道及血管周圍淋巴細胞、嗜酸性粒細胞浸潤,黏膜下層水腫、增寬，黏液栓堵塞明顯(見圖1B)。

注：A．對照組；B.哮喘組。 圖1 哮喘小鼠肺組織HE染色(×200)

2.3 基因芯片檢測結(jié)果 基因芯片上96個反應(yīng)孔進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，每張芯片自帶有3個逆轉(zhuǎn)錄對照和3個PCR陽性對照孔。通過2-ΔΔCt計算實驗組與對照組對應(yīng)基因的表達差異?；虮磉_差異的篩選標準為：基因表達倍數(shù)≥2.0確定上調(diào)基因，基因表達倍數(shù)≤-2.0確定下調(diào)基因。結(jié)果為表達上調(diào)的趨化因子21個，表達下調(diào)的趨化因子4個(見表1)；表達上調(diào)的趨化因子受體13個，其中部分受體其相應(yīng)配體表達同時上調(diào)(見表2)。

表1哮喘小鼠肺組織趨化因子的表達

SymbolGeneBankFold ChangeCC Motif CCL1 NM_0113293.19CCL11NM_0113303.43CCL12NM_0113315.30CCL17NM_01133219.20CCL2NM_0113333.47CCL20NM_01696011.03CCL22NM_0091372.31CCL3NM_0113372.60CCL5NM_0136532.52CCL7NM_0136543.69CCL8NM_02144330.50CCL9NM_0113382.81CXC MotifCXCL1NM_0081762.93CXCL10NM_0212742.66CXCL13NM_0188662.58CXCL15NM_0113392.57CXCL3NM_2033202.18CXCL5NM_00914112.18CXCL9NM_0085994.02CXCL11NM_019494-8.48CXCL14NM_019568-3.12CytokinesIL-16NM_0105512.82IL-1bNM_0083618.60Cmtm2aNM_027022-10.57Cmtm5NM_026066-6.40

表2哮喘小鼠肺組織趨化因子受體的表達

SymbolGeneBankFold ChangeUp-regulating CytokinesCC Motif CCR1NM_0099126.14CCL3CCR2NM_0099154.14CCL2,CCL7,CCL8CCR3NM_0099143.93CCL5,CCL11CCR4NM_0099163.51CCL17CCR5NM_0099174.22CCR6NM_0098352.90CCL20CCR7NM_0077193.03CCR8NM_0077206.09CXC MotifCXCR1NM_1782412.59CXCR2NM_00990924.86CXCL1,CXCL5CXCR3NM_0099102.51CXCR5NM_0075514.97CX3C MotifCX3CR1NM_0099872.25Cytokine C5ar1NM_0075772.34Fpr1NM_0135212.03

3 討論

SABioscience趨化因子及其受體PCR芯片融合了實時熒光定量PCR和功能分類基因芯片的優(yōu)點，可在一次實驗中準確定量檢測84個編碼趨化因子及其受體的關(guān)鍵基因的mRNA水平。此芯片靈敏度高，樣品使用量低，可以同時檢測表達量差異較大基因，Ct值平均差異僅有0.25個循環(huán)，可檢測超過2倍的基因表達量變化。與雄性小鼠對比，雌性小鼠對氣道致敏反應(yīng)更敏感，炎癥性反應(yīng)和炎性細胞浸潤、Th2細胞因子分泌增多更明顯[1]。本實驗采用OVA致敏和激發(fā)雌性C57BL/6小鼠建立支氣管哮喘小鼠模型，通過SABioscience基因芯片對哮喘小鼠趨化因子及其受體差異表達進行篩選和分析，為后續(xù)研究趨化因子在支氣管哮喘中的作用及細胞因子對其表達水平的影響奠定基礎(chǔ)。

支氣管哮喘是一種變態(tài)反應(yīng)性疾病，發(fā)病率逐年增加，尤其是兒童哮喘，已經(jīng)成為兒童最常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病[2]。哮喘發(fā)生過程中，趨化因子可激活淋巴細胞、單核巨噬細胞、中性粒細胞等炎性細胞，并使炎性細胞遷移到炎癥部位，在支氣管哮喘氣道炎癥中發(fā)揮重要的作用。根據(jù)趨化因子的一級結(jié)構(gòu)可將其分為CXC、CC、C及CX3C 4大類。本實驗通過基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)，支氣管哮喘小鼠肺組織表達增加2倍以上的趨化因子共有21個，其中CC類12個、CXC類9個。CCL5(RANTES)、CCL11(eotaxin)對嗜酸性粒細胞具有強大趨化作用，而CCL2(MCP-1)的趨化作用主要表現(xiàn)在單核巨噬細胞。本課題組前期實驗結(jié)果也發(fā)現(xiàn)在OVA致敏哮喘小鼠肺組織中CCL2 mRNA表達明顯高于正常小鼠。Schneider D等人用人鼻病毒(HRV)感染哮喘小鼠后，CCL2、CCL7、CCL20表達增加，CCL2抗體抑制劑能明顯減弱HRV感染哮喘小鼠的氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性，由支氣管上皮和巨噬細胞產(chǎn)生的CCL2可能有助于加重氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性[3]。哮喘小鼠肺組織CCL17主要表達于支氣管上皮細胞，哮喘組CCL17蛋白的表達顯著高于對照組，是由于正常小鼠氣道上皮細胞分泌CCL17量很少，而哮喘小鼠氣道上皮細胞和平滑肌細胞能分泌大量CCL17，與其受體CCR4特異性結(jié)合后發(fā)揮趨化作用，趨使Th2型細胞到炎癥部位。此外通過變應(yīng)原致敏和激發(fā)CCR4-/-小鼠后其氣道高反應(yīng)性明顯減低，支氣管周圍嗜酸性粒細胞浸潤減少也提示CCL17及其受體CCR4可能參與哮喘疾病的發(fā)生和發(fā)展[4]。INF-γ刺激嗜酸性粒細胞可分泌產(chǎn)生趨化因子CXCL9、CXCL10，也有研究稱CXCL9、CXCL10在哮喘和哮喘急性發(fā)作的炎癥情況下可能發(fā)揮重要作用[5]。Damian Tworek等人收集健康人和過敏原刺激者的鼻灌洗液，ELISA法檢測受試者CXCL9、CXCL10水平遠高于健康人，哮喘兒童BALF中CXCL9、CXCL10濃度遠高于對照組[6]。

趨化因子通過與相應(yīng)的趨化因子受體結(jié)合后發(fā)揮作用，本實驗結(jié)果顯示哮喘小鼠肺組織表達增加2倍以上的趨化因子受體共13個，其中與其相應(yīng)的配體趨化因子同時增高的有10個。Mizutani N[7]等人在IL-17A、IL-33聯(lián)合作用的小鼠氣道高反應(yīng)和IgE介導(dǎo)的炎癥模型中，發(fā)現(xiàn)CXCL1、CXCL5及其受體CXCR2表達增加，而CXCR2抗體抑制劑作用或消耗肺巨噬細胞能減弱中性粒細胞浸潤和氣道高反應(yīng)性。K Tremblay[8]等人用基因芯片研究CX3CR1與哮喘疾病之間的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)哮喘疾病患者CX3CR1表達增高，推論CX3CR1可作為哮喘疾病治療的新的備選基因，如攜帶5個單核苷酸多態(tài)性的CX3CR1常見等位基因則有潛在易感染哮喘風(fēng)險，故有人提出降低CX3CR1活性、抑制CX3CR1介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，使哮喘小鼠的炎癥反應(yīng)減輕，將其作為哮喘氣道炎癥治療的靶點[9]。另外，在實驗中還發(fā)現(xiàn)表達下調(diào)的細胞因子及趨化因子有4個，其在哮喘中的意義有待進一步研究。

[參考文獻]

[1] Takeda M, Tanabe M, Ito W,et al.Gender difference in allergic airway remodelling and immunoglobulin production in mouse model of asthma[J].Respirology, 2013, 18(5): 797-806.

[2] 張云梅, 蔡勇, 張貴萍, 等. 過敏原皮膚點刺試驗對小兒支氣管哮喘診斷價值[J]. 遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2011, 34(1): 82-83.

[3] Schneider D, Hong J Y, Bowman E R, et al. Macrophage/epithelial cell CCL2 contributes to rhinovirus-induced hyperresponsiveness and inflammation in a mouse model of allergic airways disease[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2013,304(3): L162-169.

[4] 李燕, 郭宇, 史小玲, 等. HSP70/CD80 DNA疫苗通過調(diào)節(jié)趨化因子及受體對哮喘小鼠氣道炎癥的影響[J]. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志, 2013, 33(2): 123-126.

[5] Dajotoy T, Andersson P, Bjartell A, et al. Human eosinophils produce the T cell-attracting chemokines MIG and IP-10 upon stimulation with IFN-gamma[J]. J Leukoc Biol, 2004, 76(3):685-691.

[6] Tworek D, Kuna P, Mlynarski W, et al. MIG(CXCL9), IP-10(CXCL10)and I-TAC (CXCL11) concentrations after nasal allergen challenge in patients with allergic rhinitis[J]. Arch Med Sci, 2013, 9(5): 849-853.

[7] Mizutani N, Nabe T, Yoshino S.IL-17A Promotes the Exacerbation of IL-33-Induced Airway Hyperresponsiveness by Enhancing Neutrophilic Inflammation via CXCR2 Signaling in Mice[J]. J Immunol, 2014, 192(4):1372-1384.

[8] Tremblay K, Lemire M, Provost V, et al. Association study between the CX3CR1 gene and asthma[J]. Genes Immun, 2006, 7(8): 632-639.

[9] Doggrell S A. CX3CR1 as a target for airways inflammation[J]. Expert Opin Ther Targets, 2011, 15(9): 1139-1142.