陳 超，趙娟娟，胡 艷，郭萌萌，陶弋婧，周 涯，秦娜琳，鄭 靜，徐 林

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室暨貴州省免疫學(xué)研究生創(chuàng)新基地，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)物理學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

近年來研究顯示，一類長度大約22nt的非編碼小分子RNA-微小RNA(microRNA,miRNA)在肺癌發(fā)生中具有關(guān)鍵調(diào)控作用，且逐漸發(fā)展為肺癌臨床診斷和基因治療的重要靶標(biāo)[1-4]。新近研究顯示miRNAs家族成員miR-7在肺癌發(fā)生中具有重要作用，其低表達(dá)與肺癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)[5]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)miR-7模擬物(mimics)可顯著抑制人肺癌細(xì)胞的體外增殖[6]。此外，基于CMV啟動子的miR-7的真核表達(dá)載體過表達(dá)miR-7可顯著抑制人肺癌細(xì)胞體內(nèi)外生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[7-9]。然而，miR-7為代表的miRNAs分子是否可作為臨床肺癌基因治療或診斷靶標(biāo)仍待繼續(xù)研究探討。

甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1(thyroid transcription factor-1,TTF-1)基因是1989年civitarale等在甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄因子，其特征性表達(dá)于甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞和肺上皮細(xì)胞中[10]。研究發(fā)現(xiàn)TTF-1在肺癌組織中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與肺癌預(yù)后密切相關(guān)，提示其可作為肺癌基因靶向表達(dá)的重要候選靶標(biāo)[11-12]。因此本研究中，我們擬利用分子克隆技術(shù)，構(gòu)建TTF-1啟動子調(diào)控miR-7的真核表達(dá)載體，并初步探討該真核載體過表達(dá)miR-7對人肺癌細(xì)胞體外生長的可能影響，以期為后續(xù)基于miR-7的臨床肺癌診斷和基因治療新靶標(biāo)開發(fā)提供前期實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 PCR試劑，Premix Ex Taq Version2.0，限制性內(nèi)切酶，快速連接酶均購自Takara公司；引物合成由上海英駿公司完成，PGL3-basic載體購自Promega公司。質(zhì)粒抽提試劑盒購自天根生化科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購自碧云天公司。人源性肺巨細(xì)胞癌95D細(xì)胞株，購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。DH5α大腸桿菌菌株由本實驗室保存。SW-CJ-2FD型超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠)；空氣恒溫?fù)u床(上海新苗醫(yī)療器械制造公司)；TD5A-WS臺式低速離心機(jī)(湘儀儀器)；IX-51倒置顯微鏡(OLYMPUS)；低溫臺式高速離心機(jī)(Thermo公司)；-80℃超低溫冰箱(Thermo公司)。

1.2 PCR擴(kuò)增miR-7基因 根據(jù)pri-miR-7序列設(shè)計引物。上游引物:5’-CGACGCGTAAGAGAGAAATGAGCCACTTGC-3’；下游引物：5’-CCCAAGCTTCCTGCCACAGTGGGGGATG-3’； 劃痕為酶切位點。以人肺癌95D細(xì)胞基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增miR-7序列，PCR條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；56 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min；35個循環(huán)；72℃ 10 min。

1.3 PGL3-basic-miR-7載體的構(gòu)建 將miR-7的PCR產(chǎn)物克隆入PGL3-basic載體中，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化、挑克隆、搖菌后提取質(zhì)粒，使用限制性內(nèi)切酶Mul I酶和Hind Ⅲ酶做雙酶切鑒定，酶切鑒定后測序，通過測序鑒定后得到正確的重組質(zhì)粒PGL3-basic-miR-7。

1.4 PCR擴(kuò)增TTF-1啟動子基因 根據(jù)TTF-1啟動子序列設(shè)計引物。上游引物：5’-CGGGGTACCTGTTTCGGCAACTAC-3’；下游引物：5’-CGACGCGTCCTTCTGGGTCCTT-3’；劃痕為酶切位點。以人肺癌95D細(xì)胞基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增TTF-1啟動子序列，PCR條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 2 min20 s；35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.5 p-T-miR-7載體的構(gòu)建 將TTF-1啟動子的PCR產(chǎn)物克隆入PGL3-basic-miR-7載體中，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化、挑克隆、搖菌后提取質(zhì)粒，使用限制性內(nèi)切酶Kpn I酶和Mul I酶做雙酶切鑒定，酶切鑒定后測序，通過測序鑒定后得到正確的重組質(zhì)粒p-T-miR-7。

1.6 Real-time PCR探針法分析各組細(xì)胞中miR-7表達(dá)情況。

1.6.1 引物設(shè)計 GAPDH 上游(5’-3’)GGTGAAGGTCGGAGTCAACG。下游(5’-3’) CAAAGTTGTCATGGATGGACC。miR-7逆轉(zhuǎn)錄GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-TCGCACTGGATACGACACAACAA，下劃線部分為莖環(huán)結(jié)構(gòu)。

注：A:下劃線部分為酶切位點。 圖1 PGL3.0-Basic-TTF-1-promoter-miR-7真核表達(dá)載體

1.6.2 總RNA提取 以上各組細(xì)胞用0.2%胰酶消化，加入適量完全培養(yǎng)基終止消化，移至離心管中，1 200 rmp離心5 min，取出倒掉上清液，彈開管底的沉淀物。向離心管中加入適量的 RNAiso Plus(10 cm295D細(xì)胞加入1 mL RNAiso Plus)，輕輕吹打，吸出至1.5 mL EP管，室溫靜置5 min，至完全融化。12 000g 4 ℃離心5 min，吸取上清液，移入新1.5 mL EP管中。向勻漿裂解液中加入氯仿(RNAiso Plus的1/5體積)，劇烈振蕩15s，待溶液充分乳化后，室溫靜置5 min，12 000g 4 ℃離心15 min。取出離心管，吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中，向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒充分混勻后，室溫下靜置10 min。12 000 g 4 ℃離心10 min。小心棄去上清，緩慢地沿離心管壁加入75%的乙醇1 mL，輕微上下顛倒洗滌，12 000 g 4 ℃離心5 min后棄去乙醇。室溫干燥沉淀2～5 min，加入適量的RNase-free水溶解沉淀。1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析RNA完整性。

1.6.3 Real-time PCR探針法檢測miR-7表達(dá) 內(nèi)參基因GAPDH逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及條件按試劑盒說明書操作，Real-time PCR反應(yīng)體系及條件： 2×SYBR?Premix Ex TaqTM10 μL，ddH2O 8 μL，cDNA 1μL，PCR Forward Primer(10 μM) 0.5 μL，PCR Reverse Primer(10μM)0.5 μL；95℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)；84 ℃采集熒光信號，以排除引物二聚體的干擾。miR-7逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及條件按試劑盒說明書操作，Real-time PCR反應(yīng)體系及條件：20×TaqMan?Small RNA Assay 1 μL，cDNA 1 μL，PCR Master Mix II 10 μL，ddH2O 8 μL；95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)；60 ℃采集熒光信號[7]。

1.7 CCK-8實驗檢測細(xì)胞增殖情況 95D細(xì)胞以3×103個細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每孔培養(yǎng)基總量200 μL，分別將p-T-miR-7重組質(zhì)粒和p-Cont質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，于37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)72 h；每孔加入10 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)3 h；使用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度(OD)值(波長450 nm)。

1.8 劃痕實驗檢測95D細(xì)胞的體外遷移 收集95D細(xì)胞，按細(xì)胞密度1×105個細(xì)胞/孔接種于24孔板，培養(yǎng)12 h；分別轉(zhuǎn)染p-T-miR-7質(zhì)粒和p-Cont質(zhì)粒，培養(yǎng)6 h；用1mL槍頭沿板中線刮出2 mm刮痕，PBS洗滌3次，顯微鏡下觀察刮痕內(nèi)無細(xì)胞，加入培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；光學(xué)顯微鏡下計算刮痕內(nèi)細(xì)胞總數(shù)，并拍照。

1.9 克隆形成實驗檢測95D細(xì)胞的長期體外生長 分別轉(zhuǎn)染p-T-miR-7質(zhì)粒和p-Cont質(zhì)粒，培養(yǎng)48 h；分別制成細(xì)胞懸液；將各轉(zhuǎn)染組按200、800個細(xì)胞/孔接種于6孔板中；置37 ℃、5%CO2中培養(yǎng)10～15 d，中間根據(jù)培養(yǎng)基變化適時更換新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見克隆時，終止培養(yǎng)，倒掉孔里的培養(yǎng)基，PBS小心洗滌2次，空氣干燥，4%多聚甲醛固定30 min，空氣干燥，用1%結(jié)晶紫染液染色30 min，洗去染液，干燥后拍照。

2 結(jié)果

2.1 PGL3-basic-miR-7真核表達(dá)載體的構(gòu)建 以人肺癌95D細(xì)胞基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增miR-7前體序列，瓊脂糖凝膠電泳后在1302bp左右的位置出現(xiàn)目的條帶(見圖2A)。經(jīng)Mul I酶和Hind Ⅲ酶雙酶切純化后，亞克隆入PGL3-basic載體中，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化、挑克隆、搖菌后做菌液PCR鑒定(見圖2B)。進(jìn)一步提取質(zhì)粒，利用Mul I酶和Hind Ⅲ酶做雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)了1302bp和4818左右的兩條帶(見圖2C)。并通過質(zhì)粒測序結(jié)果(見圖2D)，證明PGL3-basic-miR-7載體構(gòu)建成功。

注：A：PCR擴(kuò)增miR-7片段；B：菌液PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；C：重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定；D：重組質(zhì)粒的測序鑒定。 圖2 PGL3-basic-miR-7載體構(gòu)建

2.2 p-T-miR-7真核表達(dá)載體的構(gòu)建 以人肺癌95D細(xì)胞基因為模板，PCR擴(kuò)增TTF-1啟動子序列，瓊脂糖凝膠電泳后在2300bp左右的位置出現(xiàn)目的條帶(見圖3A)。經(jīng)Kpn I酶和Mul I酶雙酶切純化后，亞克隆入PGL3-basi-miR-7載體中，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化、挑克隆、搖菌后做菌液PCR鑒定(見圖3B)。進(jìn)一步提取質(zhì)粒，利用Kpn I酶和Mul I酶做雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)了2300bp和6120bp左右的兩條帶(見圖3C)。并通過質(zhì)粒測序結(jié)果(見圖3D)，證明載體構(gòu)建成功。

2.3 重組質(zhì)粒p-T-miR-7瞬時轉(zhuǎn)染人肺癌細(xì)胞后miR-7的表達(dá)水平 我們將p-T-miR-7重組質(zhì)粒和p-Cont質(zhì)粒分別體外瞬時轉(zhuǎn)染人肺癌95D細(xì)胞。72 h后，觀察細(xì)胞中miR-7成熟體的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對照組p-Cont轉(zhuǎn)染組相比，p-T-miR-7轉(zhuǎn)染組中miR-7成熟體的表達(dá)水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖4)。

2.4 瞬時轉(zhuǎn)染p-T-miR-7抑制95D細(xì)胞體外增殖 我們進(jìn)一步觀察了人肺癌95D細(xì)胞體外生長的變化。光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與p-Cont轉(zhuǎn)染組相比，p-T-miR-7轉(zhuǎn)染組95D細(xì)胞的生長明顯受到抑制，細(xì)胞數(shù)量明顯減少(見圖5A、B、C、D，P<0.05)；CCK-8檢測結(jié)果表明，細(xì)胞的增殖能力明顯下降，1.5μg和2.0μg重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的D值分別為0.85±0.02和0.83±0.02，與p-Cont組D值1.22±0.02相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖5E)。

注：A：PCR擴(kuò)增TTF-1啟動子片段；B：菌液PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；C：重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定；D：重組質(zhì)粒的測序鑒定。 圖3 p-T-miR-7載體構(gòu)建

圖4 Real-time PCR方法檢測p-T-miR-7轉(zhuǎn)染人肺癌95D細(xì)胞后miR-7的表達(dá)

2.5 瞬時轉(zhuǎn)染p-miR-7抑制95D細(xì)胞的長期體外生長 我們進(jìn)而利用克隆形成實驗，觀察了p-T-miR-7轉(zhuǎn)染后對人肺癌細(xì)胞長期生長的作用。結(jié)果顯示，在接種200 cells/well和800 cells/well條件下，p-T-miR-7轉(zhuǎn)染組中95D細(xì)胞的克隆形成數(shù)較p-Cont轉(zhuǎn)染組均明顯降低(11±3 vs 30±3個，P<0.05；80±3 vs 160±4個，P<0.05)(見圖6A～D)。這提示，p-T-miR-7轉(zhuǎn)染組中95D細(xì)胞的長期生長能力也顯著削弱。

2.6 瞬時轉(zhuǎn)染p-T-miR-7抑制95D細(xì)胞的體外遷移 我們前期研究顯示，miR-7模擬物(mimics)可顯著抑制人肺癌細(xì)胞的體外遷移能力。為了進(jìn)一步明確利用p-T-miR-7載體表達(dá)miR-7對人肺癌細(xì)胞的生物學(xué)特性的影響，我們又觀察了95D細(xì)胞體外遷移的變化。劃痕法結(jié)果顯示：與p-Cont組相比，p-T-miR-7組細(xì)胞的體外遷移能力受到顯著抑制(120±5，45±3，40±3，P<0.05)，提示p-T-miR-7載體表達(dá)miR-7可抑制95D細(xì)胞體外遷移能力。

注：A：p-Cont組(2μg)； B：p-T-miR-7組(1.5μg)；C：p-T-miR-7組(2μg)；D：A-C組的細(xì)胞計數(shù)比較(*P<0.05)，E：CCK-8實驗結(jié)果(*P<0.05)。 圖5 瞬時轉(zhuǎn)染p-T-p-miR-7對人肺癌95D細(xì)胞體外生長的影響(×100)

注：A、B：p-Cont轉(zhuǎn)染組；C、D：p-T-miR-7轉(zhuǎn)染組。A、C：200cells/well;B、D：800cells/well。 圖6 轉(zhuǎn)染p-T-miR-7抑制人肺癌95D細(xì)胞的克隆形成能力

注：A：p-Cont組(2μg)；B：p-T-miR-7組(1.5μg)；C：p-T-miR-7組(2μg)；D：A～C組劃痕部位的細(xì)胞計數(shù)比較(*P<0.05)。圖7 p-T-miR-7轉(zhuǎn)染抑制人肺癌95D細(xì)胞的體外遷移(×100)

3 討論

現(xiàn)有的臨床肺癌治療的主要方法有外科手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療。但肺癌的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移過程十分復(fù)雜，涉及多因素、多水平的分子調(diào)控機(jī)制，因此現(xiàn)有的治療方法的療效仍十分有限[13-15]。所以新治療策略的開發(fā)仍顯得十分必要。腫瘤的基因治療技術(shù)是近年來得到快速發(fā)展的一項生物學(xué)新技術(shù)，主要指將外源或內(nèi)源基因?qū)肽[瘤細(xì)胞以達(dá)到治療腫瘤的目的。目前，已知與肺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因數(shù)目龐大且機(jī)制復(fù)雜，其中近年發(fā)現(xiàn)的一類小分子RNA-miRNAs與肺癌間的關(guān)系已成為該領(lǐng)域的研究熱點和重點之一[16-17]。

越來越多的研究表明，miRNAs分子參與調(diào)控了生物體的生長發(fā)育過程并參與一系列的生命活動，如細(xì)胞的生長、侵襲、凋亡等等。如：我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)miR-7在正常腦、胸腺、淋巴結(jié)等組織中均高表達(dá)，尤其以肺組織表達(dá)水平最高[18]。而在臨床肺癌組織中，miR-7的表達(dá)水平則顯著降低，且與肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5]。同時，體外利用miR-7模擬物(mimics)可顯著抑制人肺癌細(xì)胞的體外增殖[6]。而Xiong[19]等的研究發(fā)現(xiàn)，miR-7在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中呈現(xiàn)低表達(dá)，而miR-7模擬物可以抑制細(xì)胞的增殖和遷移并誘導(dǎo)其凋亡。此外他們的研究還顯示，miR-7的表達(dá)水平與Bcl-2呈負(fù)相關(guān)性。因此，該miRNA的缺失或表達(dá)水平下調(diào)，均可導(dǎo)致Bcl-2表達(dá)水平的升高，從而促進(jìn)肺癌的發(fā)生。Lee等[20]的研究還提示，miR-7還可以增加肺癌細(xì)胞對化療的敏感性。我們在近期的研究中利用分子生物學(xué)技術(shù)成功構(gòu)建了基于CMV啟動子的miR-7的真核表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-7可顯著抑制人肺癌細(xì)胞體內(nèi)外生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[7-9]。以上的研究表明：改變腫瘤細(xì)胞中特定miRNA分子的表達(dá)水平將為肺癌的基因治療提供了新的策略和嘗試。

在本研究中，我們構(gòu)建了TTF-1啟動子調(diào)控miR-7表達(dá)的真核表達(dá)載體，并觀察其在體外的表達(dá)活性。我們以人肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞系95D細(xì)胞基因組DNA為模板，利用PCR分別擴(kuò)增TTF-1啟動子序列和miR-7前體序列，純化產(chǎn)物分別經(jīng)Kpn I和Mul I雙酶切與Mul I和HindⅢ雙酶切，克隆入pGL3-basic-載體，分別經(jīng)菌液PCR、雙酶切鑒定以及測序驗證，結(jié)果表明成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體PGL3-basic-TTF-1-promoter-miR-7(命名為p-T -miR-7)。此外，我們發(fā)現(xiàn)將p-T-miR-7瞬時轉(zhuǎn)染人肺癌95D細(xì)胞可顯著增加miR-7成熟體的表達(dá)水平，提示TTF-1啟動子可有效啟動miR-7在真核細(xì)胞中的表達(dá)。重要的是，CCK-8實驗和克隆形成實驗進(jìn)一步顯示，轉(zhuǎn)染p-T-miR-7后，95D細(xì)胞的增殖和生長能力受到明顯抑制。同時劃痕法檢測結(jié)果顯示p-T-miR-7載體過表達(dá)miR-7后還可顯著抑制95D細(xì)胞的體外遷移，與我們前期發(fā)現(xiàn)CMV啟動過表達(dá)miR-7的結(jié)果是一致的[8-9]。這些結(jié)果提示基于TTF-1啟動子調(diào)控的miR-7真核表達(dá)載體可有效表達(dá)miR-7成熟體，且具有顯著的生物學(xué)效應(yīng)。然而，TTF-1調(diào)控miR-7表達(dá)在人肺癌細(xì)胞中的確切靶向性仍待后續(xù)研究探討。

總之，在本研究中我們成功構(gòu)建TTF-1啟動子調(diào)控的miR-7真核表達(dá)載體，這為后續(xù)開發(fā)基于miR-7靶向基因治療肺癌的新策略提供了重要的前期實驗基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Hayashita Y，Osada H，Tatematsu Y，et al.A polycistronic microRNA cluster， miR-17-92，is overexpressed in human lung cancers and enhances cell proliferation[J]. Cancer Res，2005，65(21): 9628-9632.

[2] Lu Y，Thomson J M，Wong H Y，et al.Transgenic over-expression of the microRNA miR-17-92 cluster promotes proliferation and inhibits differentiation of lung epithelial progenitor cells[J]. Dev Biol，2007，310(2):442-453.

[3] Ivanovska I，Ball A S，Diaz R L，et al.MicroRNAs in the miR-106b family regulate p21/CDKN1A and promote cell cycle progression[J].Mol Cell Biol，2008，28(7): 2167-2174.

[4] Zhang J G，Wang J J， Zhao F，et al.MicroRNA-21 (miR-21) represses tumor suppressor PTEN and promotes growth and invasion in non-small cell lung cancer (NSCLC)[J].Clin Chim Acta，2010，411(11-12):846-852.

[5] 徐林，任濤,秦安東,等.MiRNA-7對人肺癌95D細(xì)胞體外侵襲的作用[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011，34(1):12-16.

[6] 徐林，任濤，周涯，等.微小 RNA-7對人肺癌95D細(xì)胞體外增殖的作用[J].腫瘤，2010，30(9):763-767.

[7] 宋永祥，李穎，秦安東，等.MiRNA-7真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定[J].西安交通大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2013，34(4):440-445.

[8] 胡燕，廖診媛，陳超，等.過表達(dá)microRNA-7通過下調(diào)CGG結(jié)合蛋白1的表達(dá)抑制人肺癌細(xì)胞生長[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2014，30(2):125-130.

[9] 朱順飛，廖珍媛，胡燕，等.微小RNA-7過表達(dá)對人肺癌細(xì)胞體內(nèi)外轉(zhuǎn)移的影響[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013，36(5):401-405.

[10] Civitareale D，Lonigro R,Sinclair A J,et al.A thyroid-specific nuclear protein essential for tissnespecific expression of the thyroglobulin promoter[J].Emboj，1989，8(9):2537-2542.

[11] Barletta J A，Perner S，Lafrate A J，et al.Clinical significance of TTF-1 protein expression and TTF-1 gene amplification in lung adenocarcinoma[J].J Cell Mol Med，2009，13(8B):1977-1986.

[12] Di Coreto C，Di Lauro V，Puglisi F，et al.Immunocytochemical expression of tissue-specific transcription factor-1 in lung carcinoma[J].J Clin Pathol，1997，50(1):30-32.

[13] Hardy D,Liu C C,Xia R,et al.Racial disparities and treatment trends in a large cohort of elderly black and white patient with nonsmall cell lung cancer[J].Cancer,2009,115(10):2199-2211.

[14] Pfeffer G P，Denissenko M F，Olivier M，et al.Tobeco smoke carcinogens.DNA damage and p53 mutations in smoking-associated cancers[J].Oncogene，2002，21(48):7435-7451．

[15] Halnsut P，Olivier M，Pfeffer G P.TP53 mutation spectrum in lung cancers and mutagenic signature of components 0f tobacco smoke：Lessons from the IARC TP53 mutation database [J].Mutagenesis，200l，16(6):551-553．

[16] Xu L，Wen Z，Zhou Y，et al.MicroRNA-7-regulated TLR9 signaling-enhanced growth and metastatic potential of human lung cancer cells by altering the phosphoinositide-3-kinase，regulatory subunit 3/Akt pathway[J].Mol Biol Cell，2013，24(1): 42-55.

[17] Lu Z，Ding L，Hong H，et al.Claudin-7 inhibits human lung cancer cell migration and invasion through ERK/MAPK signaling pathway[J].Exp Cell Res，2011，317(13):1935-1946.

[18] 鄭靜，李穎，秦安東，等.MiRNA-7在小鼠不同組織器官中表達(dá)的檢測級其意義[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2012，35(2):91-97.

[19] Xiong S，Zheng Y，Jiang P，et al.MicroRNA-7 Inhibits the Growth of Human Non-Small Cell Lung Cancer A549 Cells through Targeting BCL-2[J].Int J Biol Sci，2011，7(6): 805-814.

[20] Lee K M，Choi E J，Kim I A.MicroRNA-7 increases radiosensiticity of human cancer cells with activated EGFR-associated signaling[J].Radiother Oncol，2011，101(1):171-176.