周必英，劉美辰，楊鳳嬌

(遵義醫(yī)學(xué)院 寄生蟲(chóng)學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

豬囊尾蚴病(Cysticercosis cellulosae)是由豬帶絳蟲(chóng)(Taeniasolium)的幼蟲(chóng)囊尾蚴寄生于人或豬等而引起的人畜共患寄生蟲(chóng)病，已成為全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，在我國(guó)的感染率為0.14%～3.20%。藥物及手術(shù)治療都有其局限性，研制疫苗是防治該病的重要手段[1-3]。研究表明，豬帶絳蟲(chóng)六鉤蚴TSOL18基因具有良好的免疫原性和免疫保護(hù)性，是一種理想的疫苗候選抗原[4-7]。雙歧桿菌(Bifidobacteria)是人和哺乳動(dòng)物的腸道益生菌，也是一種基因工程受體菌。本研究擬在成功構(gòu)建豬帶絳蟲(chóng)大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒pGEX-TSOL18的基礎(chǔ)上[8],研究豬帶絳蟲(chóng)TSOL18基因在長(zhǎng)雙歧桿菌中的表達(dá)情況，為豬囊尾蚴病的疫苗研制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和菌種 質(zhì)粒pGEX-TSOL18由本課題組構(gòu)建保存；長(zhǎng)雙歧桿菌(B.longum)購(gòu)自美國(guó)菌種典藏中心。

1.2 主要試劑和儀器 質(zhì)粒小量抽提試劑盒；T4DNA連接酶、DNA Marker、BamHI和EcoRI購(gòu)自日本Takara公司；MRS培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Difico公司；重組質(zhì)粒pGEX-TSOL18和兔抗血清由本室制備[8],囊蟲(chóng)病豬血清采集自建的囊蟲(chóng)病豬感染模型，囊蟲(chóng)病患者血清由四川省疾病預(yù)防控制中心提供；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。核酸電泳裝置購(gòu)自北京六一儀器廠；PCR 儀購(gòu)自美國(guó) MJ-Research公司；厭氧發(fā)生器購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司。

1.3 重組質(zhì)粒pGEX-TSOL18電轉(zhuǎn)化B.longum將B.longum凍干粉用無(wú)菌水充分溶解后，涂布于MRS瓊脂平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)24～72 h，使其充分活化；挑取活化的單菌落，接種于4 mLMRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)至菌體OD600 nm值為0.5左右；按1∶25比例接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24～72 h；冰浴30 min，4 ℃10 000 r/min離心1 min，棄上清，沉淀用預(yù)冷的0.5 M蔗糖清洗2次，再用100 μL 0.5 M蔗糖緩沖液重懸。取100 μL與重組質(zhì)粒pGEX-TSOL181 μg混勻，冰浴10～15 min后轉(zhuǎn)移至1 mm的電擊杯中，電擊參數(shù)設(shè)置為：電壓1.25 KV、場(chǎng)強(qiáng)12.5 KV/cm、電容25 μF、電阻200 Ω、轉(zhuǎn)化時(shí)間5 ms；電擊完畢后立即將混合液轉(zhuǎn)入到900 μLMRS液體培養(yǎng)基的EP管中，37 ℃厭氧培養(yǎng)2 h；將菌液涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素的MRS瓊脂平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)24～72 h。挑取上述平板中單個(gè)菌落至1 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的MRS培養(yǎng)基的EP管中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24～72 h；將菌液4 ℃10 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀中加入250 μL 25%蔗糖溶液重溶菌體沉淀，37 ℃溫浴30 min，期間每隔5 min振蕩1次，使其充分反應(yīng)；抽提質(zhì)粒，進(jìn)行酶切、PCR和測(cè)序鑒定。篩選陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化菌株作為表達(dá)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

1.4 TSOL18基因在B.longum中的表達(dá) 選取電轉(zhuǎn)化陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化菌，接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)至OD值為0.6左右，取未誘導(dǎo)的菌液作對(duì)照，余下分別加入終濃度為0.1 mM、0.5 mM、1.0 mM IPTG37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)48 h。分別將未誘導(dǎo)與誘導(dǎo)菌液離心收集菌體，重懸于預(yù)冷PBS緩沖液中。在冰浴中超聲裂解20 min，4 ℃6 000 r/min離心15 min，留取誘導(dǎo)上清及誘導(dǎo)沉淀，用12%SDS-PAGE分析重組蛋白的表達(dá)情況。

1.5 Western blot鑒定 分別使用兔抗血清、囊蟲(chóng)病豬血清、囊蟲(chóng)病患者血清與重組蛋白雜交，鑒定表達(dá)的重組蛋白。

2 結(jié)果

2.1B.longum中重組質(zhì)粒pGEX-TSOL18的酶切鑒定 從具有氨芐青霉素抗性的B.longum中抽提的重組質(zhì)粒pGEX-TSOL18，經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，用1%瓊脂糖凝膠電泳，得到4944 bp的pGEX-1λT載體片段和393bp的TSOL18基因片段，與預(yù)期結(jié)果相符(見(jiàn)圖1)。

2.2B.longum中重組質(zhì)粒pGEX-TSOL18的PCR鑒定 以從具有氨芐青霉素抗性的B.longum中抽提的重組質(zhì)粒pGEX-TSOL18為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可得到492bp的基因片段，除去載體序列99bp，TSOL18基因?qū)嶋H的長(zhǎng)度為393bp，與預(yù)期結(jié)果相符(見(jiàn)圖2)。測(cè)序結(jié)果表明，與預(yù)期序列100%匹配，提示重組質(zhì)粒pGEX-TSOL18成功轉(zhuǎn)入長(zhǎng)雙歧桿菌。

注：M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～9：B.longum中重組質(zhì)粒pGEX-TSOL18的PCR產(chǎn)物。圖2 B.longum中重組質(zhì)粒pGEX-TSOL18的PCR鑒定

2.3 TSOL18基因在B.longum中的表達(dá) 轉(zhuǎn)化后的菌株菌體濃度達(dá)到OD值0.6左右時(shí)，分別經(jīng)0.1mM，0.5 mM，1.0mM 濃度的IPTG誘導(dǎo)，重組蛋白大小理論值為41.01KD。其中GST標(biāo)簽蛋白26.3KD，經(jīng)SDS-PAGE分析顯示，在誘導(dǎo)48h后上清和沉淀中41KD處有明顯的蛋白條帶出現(xiàn)，且大小與理論的分子量41.01KD相吻合，初步判斷重組蛋白有表達(dá)，但表達(dá)量極低(見(jiàn)圖3)。

注：M：Marker；1：未誘導(dǎo)的菌液上清；2：0.1 mM IPTG誘導(dǎo)后48h上清；3：0.5 mM IPTG誘導(dǎo)后48h上清；4：1.0 mM IPTG誘導(dǎo)后48h上清；5：未誘導(dǎo)的菌液沉淀；6：0.1 mM IPTG誘導(dǎo)后48h沉淀；7：0.5 mM IPTG誘導(dǎo)后48h沉淀；8：1.0 mM IPTG誘導(dǎo)后48h沉淀。圖3 37℃IPIG誘導(dǎo)48h表達(dá)鑒定

2.4 Western blot鑒定 如圖4所示，重溶后的重組蛋白均能與兔抗血清、囊蟲(chóng)病豬血清、囊蟲(chóng)病患者血清特異性結(jié)合，在41KD處出現(xiàn)明顯的反應(yīng)帶。

注：1：兔抗TSOL18血清；2：囊蟲(chóng)病豬血清；3：囊蟲(chóng)病患者血清；4：空白對(duì)照。圖4 Western blot鑒定

3 討論

18ku基因是Harrison等[9]和Lightowlers等[10]分別從羊絳蟲(chóng)(TO)和牛絳蟲(chóng)(TSA)六鉤蚴cDNA文庫(kù)中分離得到的陽(yáng)性克隆，該基因在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物18-GST融合蛋白可誘導(dǎo)羊和牛產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)作用。鑒于帶科絳蟲(chóng)具有較高的相似性，Gauci等[11-12]和駱學(xué)農(nóng)等[13]受此啟發(fā)，相繼成功地克隆出豬帶絳蟲(chóng)六鉤蚴TSOL18基因，該基因序列與GenBank登錄的TSOL18的同源性為99.5%,與TO18的同源性為 80.4%, 與TSA9 的同源性為77.2%，推導(dǎo)的氨基酸序列與其他帶絳蟲(chóng)宿主保護(hù)性抗原具有很高的同源性和高度的保守性，其編碼蛋白含有與宿主免疫內(nèi)分泌密切相關(guān)的FnⅢ結(jié)構(gòu)域，因此，推測(cè)TSOL18編碼蛋白在六鉤蚴入侵宿主時(shí)起重要作用，是預(yù)防豬囊尾蚴病的一種理想疫苗候選抗原。

雙歧桿菌(Bb)因其具有獨(dú)特的安全性和益生的作用，隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以其作為受體菌，在基因治療、外源蛋白表達(dá)和疫苗研制等方面的研究受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的極大關(guān)注，已在細(xì)菌、病毒、腫瘤、寄生蟲(chóng)等領(lǐng)域迅速開(kāi)展起來(lái)[14-17]，為傳染病、腫瘤和寄生蟲(chóng)病的免疫預(yù)防和免疫治療帶來(lái)了希望。為了將外源基因有效引入雙歧桿菌，需構(gòu)建大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭表達(dá)載體，本研究采用的穿梭表達(dá)載體pGEX-1λT同時(shí)含有雙歧桿菌和大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)，外源基因既可在大腸桿菌中表達(dá)，又可在在雙歧桿菌中表達(dá)。前期本課題組已成功構(gòu)建了豬帶絳蟲(chóng)重組質(zhì)粒pGEX-TSOL18，并實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的成功表達(dá)[8]，本研究在此基礎(chǔ)上，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEX-TSOL18電穿孔轉(zhuǎn)化B.longum，經(jīng)IPTG 37℃誘導(dǎo)表達(dá)48 h，SDS-PAGE結(jié)果顯示插入的外源基因TSOL18在B.longum中成功表達(dá)了相對(duì)分子質(zhì)量約為41 KD的TSOL18/GST融合蛋白，除去載體表達(dá)的GST部分約26 KD，豬帶絳蟲(chóng)TSOL18基因?qū)嶋H表達(dá)的蛋白約為15 KD，與預(yù)期結(jié)果相符。Western blot顯示，TSOL18重組蛋白能被兔抗血清、囊蟲(chóng)病豬血清和囊蟲(chóng)病患者血清所識(shí)別。表明TSOL18基因在長(zhǎng)雙歧桿菌中也得到了正確表達(dá)，表達(dá)的重組蛋白具有特異的抗原性，為下一步豬囊尾蚴病疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

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