梁大敏，束 波，楊加偉，生 欣，范 芳

(遵義醫(yī)學院 生物化學教研室，貴州 遵義 563099)

肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是臨床常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病機制和病因尚不明確。DNA雙鏈斷裂(double-stranded breaks，DSBs)是細胞最嚴重的一種損傷，可導致細胞失去分裂增殖能力而死亡，是抗癌藥物致腫瘤細胞死亡主要機制。DNA依賴性蛋白激酶亞基(DNA-dependent kinase catalytic subunit，DNA-PKcs)是參與非同源重組修復(nonhomologous end-joining，NHEJ)的核心組分，在NHEJ、VDJ重組和維持端粒結構中起關鍵作用，同時可磷酸化諸多轉錄因子和修復基因[1-2]。除此之外，有研究報道DNA-PKcs與肝癌耐藥有關[3-4]。本文將shDNA-PKcs轉染肝癌耐藥細胞株BEL7402/5-FU，通過檢測DNA-PKcs沉默對細胞化療藥物敏感性的影響，初步探索shDNA-PKcs與肝癌耐藥的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 BEL7402/5-FU細胞株購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，PRNAi-U6.1-Neo shRNA質粒購于百奧邁科生物科技有限公司，Lipofectamine?2000Reagent購于Invitrogen公司，DNA-PKcs抗體購自Assay biotech公司，P-Glycoprotein(P-gp)抗體購自abcam公司，其余試劑均為國產分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 shRNA質粒提取與鑒定 按質粒提取試劑盒提取質粒，經BamH I、Hind III雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳(1.0 %瓊脂糖，120 V，30 min)，拍照。另取菌液1 mL送至百奧邁科生物技術有限公司測序。

1.2.2 BEL7402/5-FU細胞的培養(yǎng) 將BEL7402/5-FU細胞于含10 %胎牛血清、20 μg/mL 5-FU的1 640培養(yǎng)液，37 ℃、5 %CO2條件下培養(yǎng)。細胞貼壁生長，每天換液1次，2～3 d傳代1次，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.3 實驗分組與質粒轉染 實驗分為4組：空白對照組、脂質體組、空質粒組、shDNA-PKcs實驗組。將BEL7402/5-FU細胞接種于6孔培養(yǎng)板，每孔種8×104個細胞，當細胞融合度達到80%左右時吸去培養(yǎng)液，將質粒-脂質體復合物加至相應培養(yǎng)孔中，每孔200 μL，6 h后換液。48 h后熒光顯微鏡下計數，轉染率=每個視野下的熒光細胞個數/相同視野下的細胞總數×100 %。

1.2.4 Real-time PCR檢測DNA-PKcs mRNA水平的表達 細胞總RNA的提取按Trizol? Reagent試劑盒說明書進行，Real-time PCR引物：DNA-PKcs上游5′-GTGACAAGGCAACTGTATGAGC-3，下游3′-TTCTCTAAAAACACCAGCCACA-5′，擴增片段長度163bp；β-actin上游5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3，下游3′-GGAGCGACAGGTGGAAGGTC-5′，擴增片段長度206bp。

各組樣品DNA-PKcs mRNA表達量經Real-time PCR儀檢測，PCR產物作熔解曲線分析，根據Ct值通過公式2-(△△CT)進行相對定量分析計算可得DNA-PKcs mRNA相對表達量。

1.2.5 Western blot檢測DNA-PKcs、P-gp蛋白表達 提取各組細胞總蛋白，按BCA法制作標準曲線，計算樣品蛋白濃度。取50 μg蛋白樣品與上樣緩沖液混均，SDS-PAGE電泳，轉膜，封閉1 h(RT，1 h)，孵一抗(4 ℃，過夜)，TBST洗膜3次。孵二抗(37 ℃，1 h)，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光顯色。用Quantity One定量分析軟件分析灰度比。

1.2.6 MTT法檢測藥物敏感性 取BEL7402/5-FU細胞制成細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔種1×104個細胞，培養(yǎng)12 h后轉染，6 h后棄培養(yǎng)基，分別按0、2、4、8、16、32、64、128 μg/mL加入阿霉素(ADM)、絲裂霉素(MMC)、順鉑(DDP)和按0、3、6、12、24、48、96、192 μg/mL加入5-氟尿嘧啶(5-FU)。48 h后棄培養(yǎng)液，加180 μL無血清培養(yǎng)液、20 μL MTT(0.5%)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，加150 μL二甲基亞砜(DMSO)，低速震蕩10 min，全自動酶標儀(490 nm)測定各孔吸光度值。用Graphpad prism5.0計算各個藥物的IC50。

2 結果

2.1 shDNA-PKcs質粒的鑒定 酶切電泳結果顯示：shDNA-PKcs質粒組、陰性質粒組約6300bp(見圖1)。shDNA-PKcs質粒測序結果顯示質粒插入序列如下：GATCCGGGCGCTAATCGTACTGAA TTCAAGAGATTCAGTACGATTAGCGCCCTTTTTTA。

2.2 熒光計數檢測shDNA-PKcs質粒的轉染率 結果顯示：shDNA-PKcs質粒轉染效率約為62.2%(見圖2)。

2.3 Real time PCR檢測DNA-PKcs、P-gp mRNA水平表達 實驗結果使用2-△△Ct法進行分析，結果顯示(見表1)：空白對照組、脂質體組、質粒對照組DNA-PKcs、P-gp mRNA表達無明顯差異(P>0.05)，shDNA-PKcs實驗組DNA-PKcs、P-gp mRNA的表達較對照組明顯下調(P<0.01)。DNA-PKcs mRNA水平的沉默效率為82.6 %。

注：1：shDNA-PKcs質粒組；2：陰性質粒組。圖1 酶切電泳結果

注：A:普通光源;B:熒光光源。 圖2 shDNA-PKcs質粒細胞水平轉染效率(×100)

分組DNA-PKcs mRNA水平(Ct值)P-gp mRNA水平(Ct值)β-actin mRNA水平(Ct值)DNA-PKcs相對倍數變化(2-△△Ct)P-gp相對倍數變化(2-△△Ct)空白對照組23.133±0.16423.010±0.21317.207±0.3371.000±0.0001.000±0.000脂質體組22.493±0.13522.400±0.15816.630±0.4781.045±0.1011.026±0.095質粒對照組22.680±0.27422.657±0.32117.047±0.6901.226±0.0521.144±0.053實驗組26.013±0.562**24.307±0.494**17.537±0.4680.174±0.083**0.512±0.014**

注：**:與空白對照組相比P<0.01。

2.4 Western blot檢測DNA-PKcs、P-gp蛋白水平表達 結果顯示：空白對照組、脂質體組、質粒對照組DNA-PKcs、P-gp表達無明顯差異(P>0.05)，shDNA-PKcs實驗組DNA-PKcs、P-gp蛋白表達均下降，與對照組比較差異都具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，DNA-PKcs蛋白水平的沉默效率為71.8%(見表2，圖3)。

分組DNA-PKcs/β-actinP-gp/β-actin空白對照組1.214±0.2061.254±0.269脂質體組1.237±0.1351.301±0.053質粒對照組1.118±0.2121.167±0.120實驗組0.282±0.032**0.225±0.001**

注：**:與空白對照組相比P<0.01。

2.5 MTT法檢測BEL7402/5-FU細胞的藥物敏感性 結果顯示(見表3)：空白對照組、脂質體組、質粒對照組對ADM、DDP、MMC、5FU的IC50差異

注:1：空白對照組；2：脂質體組；3：質粒對照組；4：shDNA-PKcs實驗組。 圖3 各組細胞DNA-PKcs、P-gp蛋白的表達

不明顯(P>0.05),而shDNA-PKcs實驗組對ADM、5FU IC50降低，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)?？梢奃NA-PKcs的沉默可增加肝癌耐藥細胞BEL7402/5-FU對ADM、5FU的敏感性。

分組ADMDDPMMC5-FU空白對照組25.905±1.05010.539±1.3673.042±0.67386.980±4.278脂質體組24.705±1.0259.517±3.5472.654±0.72384.070±5.742質粒對照組23.860±2.94210.569±1.8112.718±0.50983.415±5.230實驗組14.260±2.450*4.625±0.0211.243±0.19563.720±6.028*

注：*:與空白對照組相比P<0.05。

3 討論

肝癌是一個最常見的、致命的腫瘤。目前臨床上常采用手術聯(lián)合放化療，但長期放化療后，易出現耐藥，這可能與DNA損傷信號失調和DNA損傷修復有關[5-6]。其中，由電離輻射或抗癌藥物如：阿霉素(拓補異構酶II抑制劑)等引起的DSBs是最嚴重的損傷。然而，在哺乳動物細胞中以DNA-PK為核心的非同源重組修復(non-homologous end joining，NHEJ)在DSBs修復的中發(fā)揮主要作用。

DNA -PKcs由4128個氨基酸組成的相對分子量為469 kD的大分子量蛋白質，基因位于染色體8 ql1，含有一系列磷酸化位點以及高度保守區(qū)[7]。DSBs發(fā)生后，DNA-PKcs與Ku70/80結合到DNA末端，通過自身磷酸化和磷酸化下游蛋白如：Artemis、DNA ligase4、XRCC4和Cernunnos等完成DNA損傷修復[8]。DNA-PKcs被認為具有腫瘤抑制功能，能維持基因組穩(wěn)定性[9]。大量研究發(fā)現，在許多腫瘤患者經放化療后，DNA-PKcs蛋白表達活性增加，且DNA-PKcs表達量的多少直接影響腫瘤的進一步治療。因此，本實驗采用RNAi技術沉默DNA-PKcs，檢測肝癌細胞對4種常用化療藥物的敏感性，結果發(fā)現沉默后能夠明顯增加肝癌細胞對ADM、5-FU的敏感性。目前已有一些研究表明下調DNA-PKcs能增加腫瘤細胞對藥物的敏感性[10-11]。然而，在耐順鉑的神經膠質瘤患者、口腔癌放療患者中已發(fā)現DNA-PKcs活性增加[12]，表明放化療后機體產生了耐藥性。為了進一步了解BEL7402/5-FU細胞耐藥的可能機制，本實驗用Real time PCR和Western blot法檢測了各組細胞的多藥耐藥蛋白P-gp mRNA和蛋白表達情況。實驗檢測結果顯示DNA-PKcs沉默后P-gp mRNA和蛋白表達減少，提示DNA-PKcs的沉默可能通過下調P-gp的表達，從而增加BEL7402/5-FU細胞對化療藥物的敏感性。因此推測DNA-PKcs沉默降低細胞耐藥性的機制除了與抑制DNA損傷修復途徑有關，還可能與下調P-gp表達存在一定的聯(lián)系，具體機制還需作進一步的實驗研究。目前也有少量研究表明通過抑制DNA-PKcs下調P-gp，從而增加耐藥細胞對化療藥物的敏感性[3-4]。但DNA-PKcs如何調控P-gp逆轉耐藥，目前說法不一，還需要進一步研究。

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