趙杰，陳秀娟，劉芳，梁琳，梁磊，王薩仁，侯石磊

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心，呼和浩特 010050）

凍融胚胎移植（FET）已成為輔助生殖技術(shù)（ART）中最重要的衍生技術(shù)之一，它不僅能夠合理限制新鮮周期移植胚胎數(shù)、降低多胎率、提高單次取卵周期累計(jì)妊娠率，而且還可避免由于多次超促排卵給患者帶來(lái)的醫(yī)療風(fēng)險(xiǎn)和治療費(fèi)用。影響FET臨床妊娠結(jié)局的因素較多，而胚胎復(fù)蘇后情況及胚胎的發(fā)育潛能是影響因素之一。本研究回顧分析了我中心冷凍胚胎融解后存活情況及過(guò)夜培養(yǎng)后發(fā)育情況對(duì)臨床妊娠結(jié)局的影響。

材料與方法

一、研究對(duì)象

選擇2012年5月至2013年10月在本中心因新鮮周期未移植及新鮮周期移植妊娠失敗行FET的患者，共303 例，349個(gè)周期，女性患者平均年齡（32.7±4.9）歲、范圍23～42歲，不育年限（5.15±4.08）年、范圍1～16年。各組年齡、獲卵數(shù)比較無(wú)顯著性差異，不育原因?yàn)榕蕉嗄衣殉簿C合征、輸卵管阻塞、男方無(wú)精子或少精子癥、行夫精人工授精3周期失敗及不明原因不育等，排除子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌癥等有明確影響子宮內(nèi)膜環(huán)境的患者。內(nèi)膜準(zhǔn)備方案為自然周期183 個(gè)，人工替代周期166個(gè)。

二、方法

1.控制性超促排卵：新鮮取卵周期的控制性促排卵方案按照我中心常規(guī)方案［1］進(jìn)行，根據(jù)患者情況，選擇超長(zhǎng)方案、長(zhǎng)方案、短方案、拮抗劑方案進(jìn)行促排卵，在超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵手術(shù)，取卵后常規(guī)行體外受精（IVF）、卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）及胚胎培養(yǎng)。

2.冷凍胚胎選擇：胚胎質(zhì)量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)文獻(xiàn)［2］進(jìn)行評(píng)級(jí)：選擇Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)胚胎，且第2日細(xì)胞數(shù)≥2，第3日細(xì)胞數(shù)≥4；碎片≤50% 的胚胎用于冷凍。

3.胚胎冷凍及解凍：采用玻璃化冷凍試劑套裝（Vitrolife，瑞典）進(jìn)行冷凍，用冷凍環(huán)（Hampton Research，美國(guó)）作為載體。冷凍過(guò)程：所用試劑均要求在37℃下平衡30 min，將胚胎放入含有10mg／ml人血清白蛋白（HSA）的磷酸緩沖液（PBS）中平衡5min；移入含10mg／ml HSA、7.5%乙二醇（EG）及7.5% 二甲基亞砜（DMSO）的PBS（冷凍液1）中2 min；將胚胎移入含10 mg／ml HSA、15%EG 及15%DMSO 的PBS（冷凍液2）中，反復(fù)吹吸，將冷凍環(huán)在冷凍液2中蘸一下，形成液體膜，用吸管將胚胎放入冷凍環(huán)液體膜上，置入液氮中，將冷凍環(huán)旋到冷凍管上（胚胎在冷凍液2中的時(shí)間為20～30s）。解凍過(guò)程：于移植前一天下午解凍，解凍前將解凍試劑（Vitrolife，瑞典）平衡至37℃，將含胚胎的冷凍環(huán)小心旋下冷凍管，從液氮取出，空氣中2s，置入復(fù)蘇液Ⅰ（含1.0mol／L 蔗糖及10mg／ml HSA 的PBS）中，停留30s，轉(zhuǎn)移到復(fù)蘇液Ⅱ（含0.5 mol／L 蔗 糖 及10 mg／ml HSA 的PBS）中停留1min，再移到復(fù)蘇液Ⅲ（含0.25mol／L蔗糖及10mg／ml HSA 的PBS）中停留2min，最后在平 衡 液（含10 mg／ml HSA 的PBS）中 平 衡5min，移至已平衡的含5mg／ml HSA 的囊胚培養(yǎng)液（Vitrolife，瑞典）中。

4.胚胎培養(yǎng)及觀察：解凍后的胚胎放到平衡好的囊胚培養(yǎng)液中，檢查透明帶的完整性、卵漿的透亮程度，如有50% 以上卵裂球受損，則視為死亡。在6%CO2、5%O2、89%氮?dú)馀囵B(yǎng)箱內(nèi)過(guò)夜培養(yǎng)。移植日觀察復(fù)蘇后胚胎情況，觀察胚胎是否生長(zhǎng)，將胚胎情況進(jìn)行記錄。

5.分組：（1）根據(jù)所移植胚胎卵裂球的損傷程度，分為3 組：移植的胚胎均無(wú)損傷的為完整組（A1，n＝193），全部移植的胚胎均有卵裂球損傷的為損傷組（A2，n＝30），移植既有無(wú)卵裂球損傷的胚胎又有卵裂球損傷的胚胎為損傷混合組（A3，n＝126）。（2）解凍后胚胎經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)，根據(jù)其生長(zhǎng)情況分為3組：所移植胚胎均有不同程度生長(zhǎng)的胚胎為生長(zhǎng)組（B1，n＝187），所移植胚胎均未見(jiàn)生長(zhǎng)的胚胎為未生長(zhǎng)組（B2，n＝46），所移植胚胎既有生長(zhǎng)的胚胎又有未生長(zhǎng)胚胎即為生長(zhǎng)混合組（B3，n＝116）。（3）在生長(zhǎng)組及生長(zhǎng)混合組中，根據(jù)胚胎是否發(fā)育為桑葚胚情況，分為2組：有胚胎達(dá)到桑葚胚狀態(tài)的為桑葚胚組（C1，n＝86），無(wú)胚胎達(dá)到桑葚胚狀態(tài)的為無(wú)桑葚胚組（C2，n＝217）。

6.內(nèi)膜及黃體準(zhǔn)備：內(nèi)膜準(zhǔn)備方案：自然周期：月經(jīng)第10 天起B(yǎng) 超監(jiān)測(cè)，主導(dǎo)卵泡平均直徑達(dá)14mm時(shí)，開(kāi)始檢測(cè)血清中黃體生成素（LH）值，出現(xiàn)峰值后第4 天行FET；如主導(dǎo)卵泡發(fā)育到16～20mm時(shí)，未測(cè)出LH 峰，則肌注人絨毛膜促性腺激素（HCG，麗珠醫(yī)藥）5 000 ～10 000U，第4天后行FET。激素替代周期：月經(jīng)第2 天起予口服補(bǔ)佳樂(lè)（BAYER，法國(guó)），行陰道B 超監(jiān)測(cè)，子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm 時(shí)，肌注黃體酮（P，浙江仙琚制藥）40 ～60mg／d，于肌注P的第5天行FET。

7.確定妊娠及隨訪：移植后14 d 行血清β-HCG 檢測(cè)，提示未妊娠即停用P，若血清β-HCG檢測(cè)提示妊娠，則繼續(xù)黃體支持。移植后24d超聲檢查見(jiàn)孕囊、胚芽，移植后35d超聲檢查心管搏動(dòng)者確定為臨床妊娠，繼續(xù)黃體支持至妊娠10～12周。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

釆用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，率的比較采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、基本情況

共解凍303例患者的349個(gè)周期，無(wú)取消周期；解凍胚胎834 個(gè)，存活789 個(gè)，存活率94.60%；移植胚胎789 個(gè)，種植170 個(gè)，種植率21.55%；妊娠144個(gè)周期，平均妊娠率41.26%；活產(chǎn)96個(gè)周期，活產(chǎn)率66.67%；流產(chǎn)（包括早、中、晚期）44個(gè)周期，流產(chǎn)率30.56%；異位妊娠6個(gè)周期，占4.17%。

二、胚胎損傷情況對(duì)妊娠結(jié)局的影響

解凍后移植胚胎完整組（A1）共193個(gè)周期，妊娠率45.08%，種植率24.25%，活產(chǎn)率70.11%，流產(chǎn)率27.59%；損傷組（A2）共30 個(gè)周期，妊娠率20%，種植率11.11%，活產(chǎn)率50%，流產(chǎn)率50%；損傷混合組（A3）126個(gè)周期，妊娠率40.48%；種植率19.72%，活產(chǎn)率62.75%，流產(chǎn)率33.33%（表1）。完整組（A1）在妊娠率、種植率上顯著高于損傷組（A2）（P＝0.01、P＝0.002），損傷混合組（A3）在妊娠率上顯著高于損傷組（A2）（P＝0.036），活產(chǎn)率及流產(chǎn)率比較，組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

三、胚胎生長(zhǎng)情況對(duì)妊娠結(jié)局的影響

過(guò)夜培養(yǎng)后，生長(zhǎng)組（B1）187 個(gè)周期，妊娠率47.06%，種植率26.34%，活產(chǎn)率69.32%，流產(chǎn)率27.27%；未 生 長(zhǎng) 組（B2）46 個(gè) 周 期，妊 娠 率34.78%；種植率為17%，活產(chǎn)率68.75%，流產(chǎn)率31.25%；生 長(zhǎng) 混 合 組（B3）116 個(gè) 周 期，妊 娠 率34.48%，種植率為16.13%，活產(chǎn)率55.0%，流產(chǎn)率37.5%。生長(zhǎng)組（B1）妊娠率顯著高于生長(zhǎng)混合組（B3）（P＝0.031），而種植率顯著高于未生長(zhǎng)組（B2）及生長(zhǎng)混合組（B3）（P＝0.049、0.002）；活產(chǎn)率及流產(chǎn)率無(wú)顯著性差異（表1）。

四、過(guò)夜培養(yǎng)后有無(wú)桑葚胚對(duì)妊娠結(jié)局的影響

過(guò)夜培養(yǎng)后，生長(zhǎng)組、生長(zhǎng)混合組共計(jì)303個(gè)周期，桑葚胚組（C1）86個(gè)周期，妊娠47個(gè)周期，妊娠率為54.65%，種植率為28.28%；無(wú)桑葚胚組（C2）共217個(gè)周期，妊娠81個(gè)周期，妊娠率為37.33%，種植率為19.76%（表1）。兩組妊娠率、種植率比較均有顯著差異（P＝0.006、0.015）；兩組活產(chǎn)率及流產(chǎn)率無(wú)顯著性差異（表1）。

討 論

ART 臨床應(yīng)用中，現(xiàn)多在D3卵裂期胚胎進(jìn)行移植，胚胎冷凍也多在此階段進(jìn)行［3］。冷凍胚胎解凍后卵裂球的存活程度反映了胚胎的內(nèi)在質(zhì)量，能更好地承受冷凍過(guò)程的胚胎有著更好的發(fā)育潛能［4］，冷凍和解凍過(guò)程中，一些胚胎的卵裂球細(xì)胞可能會(huì)損傷，這些損傷細(xì)胞可影響其他細(xì)胞生存及胚胎的進(jìn)一步發(fā)育。雖有報(bào)道，細(xì)胞部分壞死的冷凍胚胎與細(xì)胞完整冷凍胚胎相比有相同的發(fā)育潛力，但冷凍過(guò)程本身可引起重要的細(xì)胞內(nèi)改變［5］，冷凍胚胎的壞死細(xì)胞可能對(duì)存活細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，減少胚胎發(fā)育潛能等［6］。

表1 解凍后胚胎損傷情況及胚胎生長(zhǎng)情況與臨床結(jié)局［（±s），n（%）］

表1 解凍后胚胎損傷情況及胚胎生長(zhǎng)情況與臨床結(jié)局［（±s），n（%）］

注：與損傷組（A2）比較，△P＜0.05；與生長(zhǎng)組（B1）比較，＊P＜0.05；與無(wú)桑葚胚組（C2）比較，＃P＜0.05

組 別 周期數(shù) 年齡（歲） 獲卵數(shù)（個(gè)） 移植數(shù)（個(gè)） 妊娠率 種植率 活產(chǎn)率 流產(chǎn)率 異位妊娠率完整組（A1） 193 32.74±5.16 11.15±7.48 2.26±0.58 87／193（45.08）△106／437（24.25）△61／87（70.11）24／87（27.59）2／87（2.29）損傷組（A2） 30 32.92±5.72 12.33±7.16 2.1±0.66 6／30（20.00）7／63（11.11） （3／6） （3／6） 0損傷混合組（A3） 126 32.49±4.60 10.43±7.15 2.29±0.54 51／126（40.48）△4／51（7.84）組 別 周期數(shù) 年齡（歲） 獲卵數(shù)（個(gè)） 移植數(shù)（個(gè)） 妊娠率 種植率 活產(chǎn)率 流產(chǎn)率 異位妊娠率57／289（19.72）32／51（62.75）17／51（33.33）生長(zhǎng)組（B1） 187 32.05±5.34 11.21±7.52 2.19±0.55 88／187（47.06）108／410（26.34）61／88（69.32）24／88（27.27）3／88（3.41）未生長(zhǎng)組（B2） 46 32.07±5.22 11.89±6.8 2.17±0.57 16／46（34.78）17／100（17.00）＊11／16（68.75）5／16（31.25） 0生長(zhǎng)混合組（B3） 116 32.76±4.70 10.35±7.27 2.41±0.57＊ 40／116（34.48）＊45／279（16.13）＊22／40（55.00）15／40（37.50）3／40（7.50）組 別 周期數(shù) 年齡（歲） 卵數(shù)（個(gè)） 移植數(shù)（個(gè)） 妊娠率 種植率 活產(chǎn)率 流產(chǎn)率 異位妊娠率有桑葚胚（C1） 86 32.03±4.90 12.06±7.44 2.30±0.58 47／86（54.65）＃無(wú)桑葚胚（C2） 217 33.17±5.45 10.96±7.40 2.26±0.57 81／217（37.33）56／198（28.28）＃97／491（19.76）30／47（63.83）53／81（65.43）15／47（31.91）24／81（29.63）2／47（4.26）4／81（4.94）

本研究中，損傷組妊娠率顯著低于完整組及損傷混合組，種植率顯著低于完整組，提示胚胎的損傷程度是影響妊娠結(jié)局的因素。在活產(chǎn)率上損傷組（50.0%）及損傷混合組（62.75%）均低于完整組（70.11%），而 流 產(chǎn) 率 卻 高 于 完 整 組（分 別 為50.0%、33.33%、27.59%），但無(wú)顯著性差異，可以認(rèn)為胚胎的損傷也是活產(chǎn)率降低及流產(chǎn)率升高的因素之一。然而，可能由于本研究數(shù)據(jù)量較少而未顯現(xiàn)出有顯著性差異，故有待進(jìn)一步觀察。

在對(duì)完整組、損傷組、損傷混合組過(guò)夜培養(yǎng)后觀察胚胎生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)完整組、混合組及損傷組胚胎的生 長(zhǎng) 率 逐 漸 降 低（分 別 為78.03%、62.63%、49.21%），且三組比較差異均有顯著性，所以胚胎卵裂球損傷情況是影響胚胎生長(zhǎng)的因素之一。

提前解凍胚胎，過(guò)夜培養(yǎng)后觀察復(fù)蘇后胚胎是否繼續(xù)生長(zhǎng)，對(duì)于評(píng)價(jià)胚胎種植潛能具有很大的意義［7］。Van der Elst等［8］認(rèn)為，復(fù)蘇后卵裂球繼續(xù)發(fā)育可能對(duì)于著床時(shí)胚胎與子宮內(nèi)膜的同步性更有利。此外，Laverge等［9］對(duì)復(fù)蘇后無(wú)生長(zhǎng)的胚胎進(jìn)行熒光原位雜交，發(fā)現(xiàn)這類(lèi)胚胎往往表現(xiàn)染色體異常，包括單倍體、三倍體、四倍體甚至六倍體和嵌合體的發(fā)生，僅有20% 左右的胚胎表現(xiàn)為正常的二倍體，因此提出建議不要移植這類(lèi)復(fù)蘇后無(wú)進(jìn)一步生長(zhǎng)的胚胎。本研究顯示，胚胎解凍后過(guò)夜培養(yǎng)，所移植胚胎均有生長(zhǎng)的生長(zhǎng)組在妊娠率、種植率上高于無(wú)生長(zhǎng)組及生長(zhǎng)混合組，可見(jiàn)胚胎經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)后有卵裂球細(xì)胞生長(zhǎng)能夠顯著提高種植率及妊娠率，生長(zhǎng)混合組及未生長(zhǎng)組在妊娠率、種植率上水平相當(dāng)，對(duì)于這一類(lèi)患者來(lái)說(shuō)，只要胚胎有未生長(zhǎng)的，則預(yù)示此周期中所移植的胚胎發(fā)育潛能均不是很好，對(duì)妊娠及種植不利。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在未生長(zhǎng)組、生長(zhǎng)混合組、生長(zhǎng)組中的胚胎有損傷的病例占的比例分別是75%、53%及38%。由此可見(jiàn)，解凍后，細(xì)胞部分壞死的胚胎與細(xì)胞完整胚胎相比，其發(fā)育潛能較差，從而影響到妊娠率及種植率，并最終影響到活產(chǎn)率及流產(chǎn)率。

桑葚胚是有發(fā)育潛能的早卵裂期胚胎發(fā)育而來(lái)，本研究顯示，復(fù)蘇D3 卵裂期胚胎經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)后，在生長(zhǎng)組及混合生長(zhǎng)組周期中，有發(fā)育到桑葚胚周期的妊娠率及種植率上均顯著性高于未見(jiàn)到桑葚胚的周期，可見(jiàn)在第4天發(fā)育到桑葚胚的胚胎，其發(fā)育潛能較在第4天未見(jiàn)到桑葚胚的要高，這種胚胎往往預(yù)示著在第5天就能夠發(fā)育為囊胚，從而是能夠獲得較高的妊娠率，與陳雅等［10］的報(bào)道相符合。

綜上所述，復(fù)蘇D3卵裂期胚胎，卵裂球細(xì)胞的壞死情況影響妊娠結(jié)局，經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)，有卵裂球細(xì)胞生長(zhǎng)的胚胎能夠獲得較高的種植率及妊娠率，且生長(zhǎng)為桑葚胚的病例妊娠率及種植率均高于未獲得桑葚胚的病例?？梢?jiàn)選擇質(zhì)量較好的胚胎進(jìn)行冷凍，可使胚胎冷凍、解凍技術(shù)而對(duì)胚胎損傷的減少，亦是提高凍融胚胎妊娠結(jié)局的關(guān)鍵。

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