劉忠慧，黃鑫，郝翠芳＊

（1.青島大學(xué)，青島 266071；2.山東煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，煙臺(tái) 264000）

多囊卵巢綜合征（PCOS）是育齡女性最常見的內(nèi)分泌紊亂性疾病［1］，發(fā)病率約為5%～10%［2］。有研究稱，根據(jù)鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)診斷出的PCOS，其發(fā)病率可達(dá)18%［3-4］?，F(xiàn)今在全球范圍內(nèi)PCOS發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)，其復(fù)雜的生理及代謝改變可影響女性一生的健康［3］，但病因及發(fā)病機(jī)制至今未明［5］。PCOS是導(dǎo)致育齡期女性月經(jīng)紊亂和無排卵型不孕的主要原因［6］。并有研究指出，約90%的PCOS女性伴不孕［4］。因此關(guān)于PCOS發(fā)病機(jī)制的研究不僅是國(guó)內(nèi)外婦科內(nèi)分泌學(xué)研究的熱點(diǎn)，也是輔助生殖技術(shù)（ART）研究的重點(diǎn)。越來越多的證據(jù)表明，胰島素抵抗、低度慢性炎癥及氧化應(yīng)激（OS）與PCOS的發(fā)生發(fā)展有直接的關(guān)系［7-9］。

卵泡液提供卵母細(xì)胞發(fā)育的微環(huán)境［5］。眾所周知，PCOS患者存在卵母細(xì)胞成熟障礙。同時(shí)有研究顯示，OS與卵母細(xì)胞成熟度、胚胎發(fā)育潛能有直接的關(guān)系［10］。本研究比較接受體外受精-胚胎移植（IVF-ET）的PCOS患者和非PCOS患者卵泡液中OS相關(guān)指標(biāo)的水平及其與IVF 結(jié)局參數(shù)的關(guān)系，以期揭示OS對(duì)PCOS患者IVF結(jié)局的影響。

材料和方法

一、研究對(duì)象

患者均來源于2013年7月至2014年3月在煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院行IVF-ET 者。PCOS 組25 例，PCOS的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2003年歐洲人類生殖和胚胎學(xué)會(huì)／美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)會(huì)（ESHRE／ASRM）制訂的鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)［11-13］，符合以下三項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)中的兩項(xiàng)者即可診斷：（1）稀發(fā)排卵或無排卵；（2）超聲顯示為卵巢多囊樣改變（至少一側(cè)卵巢可見12個(gè)及以上且直徑為2～8mm 的卵泡和（或）卵巢體積＞10ml）；（3）有高雄激素的臨床和（或）生物化學(xué)征象，排除先天性腎上腺皮質(zhì)增生、庫(kù)欣綜合征、分泌雄激素的卵巢和腎上腺腫瘤。對(duì)照組23 例非PCOS患者，入選標(biāo)準(zhǔn)為繼發(fā)性不孕，因輸卵管因素于我院行IVF 治療的患者，并排除患有其他內(nèi)分泌疾病，如糖尿病、高血壓、甲狀腺功能亢進(jìn)、甲狀腺功能低下及子宮內(nèi)膜異位癥等影響妊娠的疾病。該研究經(jīng)煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均簽署相關(guān)的知情同意書。

（J Reprod Med2014，23（12）：976-980）

二、方法

1.卵泡液收集：取卵日超聲引導(dǎo)下首先穿刺位置最低的直徑在18～22mm 的一個(gè)大卵泡，穿刺時(shí)穿刺針盡量避開血管，適當(dāng)負(fù)壓抽吸，單獨(dú)將該管無血染的卵泡液送入胚胎實(shí)驗(yàn)室，單獨(dú)放置并進(jìn)行標(biāo)注姓名、日期等相關(guān)信息，實(shí)驗(yàn)室在解剖鏡下尋找卵母細(xì)胞，完成找卵后，立即將卵泡液于2 500r／min下離心20min，將清亮無血染的上清液用移液器分裝于Eppendorf管中，立即-80℃冷凍保存，批量檢測(cè)，并避免反復(fù)凍融，保證測(cè)定的可靠性。

2.樣本檢測(cè)：卵泡液中超氧化物歧化酶（SOD）活力測(cè)定，試劑盒購(gòu)自美國(guó)BioVision公司，采用化學(xué)發(fā)光法，測(cè)定步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。卵泡液抑制羥自由基（·OH，活性氧中最活躍的一種）產(chǎn)生的能力測(cè)定及丙二醛（MDA）測(cè)定，采用南京建成生物公司試劑盒，分別利用Fenton反應(yīng)、硫代巴比妥酸法進(jìn)行測(cè)定。卵泡液中總抗氧化能力（TAC）測(cè)定采用化學(xué)發(fā)光法，試劑盒購(gòu)自南京建成生物公司。其余指標(biāo)如晚期氧化蛋白產(chǎn)物（AOPP）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、還原型谷胱甘肽（GSH）、輔酶Q10的測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA），試劑盒購(gòu)自上海義森生物科技公司。

3.臨床資料及檢測(cè)指標(biāo)：采集患者年齡、基礎(chǔ)內(nèi)分泌、測(cè)量身高、體重并計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)（BMI）等資料。于月經(jīng)第2～3 天測(cè)定血清卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）、睪酮（T）水平。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式描述，兩組間各項(xiàng)指標(biāo)比較首先采用方差齊性檢驗(yàn)和正態(tài)性檢驗(yàn)，若方差齊則用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，方差不齊則采用校正t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的指標(biāo)采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、患者臨床特征及性激素水平比較

研究對(duì)象的一般臨床特征及性激素水平。PCOS組基礎(chǔ)E2、T、LH、LH／FSH 水平均高于對(duì)照組，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而對(duì)照組基礎(chǔ)FSH 水平高于PCOS 組（P＜0.05）。除此之外，兩組患者其他指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（表1）。

二、兩組獲卵數(shù)、受精率、優(yōu)胚率比較

研究對(duì)象的獲卵數(shù)、成熟卵率（MⅡ卵數(shù)／獲卵數(shù)）、受精率（受精的卵數(shù)／獲卵數(shù)）、優(yōu)胚率（優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)／受精卵數(shù)）比較。PCOS 組有較高的獲卵數(shù)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.006），卵母細(xì)胞成熟率、受精率及IVF優(yōu)胚率兩組間無顯著性差異（P＞0.05）（表2）。

三、兩組取卵日卵泡液中相關(guān)氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較

代表氧化狀態(tài)的指標(biāo)：晚期AOPP、脂質(zhì)MDA、GSSG；表示抗氧化或還原狀態(tài)的指標(biāo)：TAC、經(jīng)典的酶類抗氧化物超氧化物歧化酶（SOD）、卵泡液抑制·OH 產(chǎn)生的能力、抗氧化輔酶Q10（CoQ10）、GSH；代表卵泡液中的總體氧化／抗氧化平衡狀態(tài)的GSH／GSSG。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PCOS 組GSH／GSSG 較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.036）（表3）。

表1 PCOS組和對(duì)照組基本臨床資料比較（±s）

表1 PCOS組和對(duì)照組基本臨床資料比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，＊P＜0.05

組 別 例數(shù) 年齡（歲）BMI（kg／m2）基礎(chǔ)FSH（U／L）基礎(chǔ)LH（U／L） LH／FSH 基礎(chǔ)T（nmol／L）基礎(chǔ)E2（pmol／L）7 0.77±0.24 0.79±0.25 119.17±45.90 PCOS組 25 30.68±2.73 24.14±3.03 5.24±1.14＊ 9.21±5.44＊ 1.74±0.80＊ 1.47±0.64＊ 149.14±49.12對(duì)照組 23 31.78±3.62 23.08±3.07 6.38±1.53 4.83±1.7＊

表2 PCOS組和對(duì)照組IVF結(jié)局指標(biāo)的比較（±s）

表2 PCOS組和對(duì)照組IVF結(jié)局指標(biāo)的比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，＊P＜0.05

組 別 例數(shù) 獲卵數(shù)（個(gè)） 成熟卵率（%） 受精率（%） 優(yōu)胚率（%）23 12.78±5.92 0.71±0.20 0.78±0.18 0.51±0.16 PCOS組 25 17.56±5.58＊對(duì)照組0.75±0.15 0.78±0.17 0.57±0.23

表3 PCOS組和對(duì)照組氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)比較（±s）

表3 PCOS組和對(duì)照組氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，＊P＜0.05

組 別 例數(shù) MDA（nmol／L） 抑制·OH（U／L） AOPP（μmol／L） GSSG（nmol／L）對(duì)照組 23 2.30±1.13 0.15±0.01 148.62±7.40 0.07±0.1 0 PCOS組 25 2.99±0.67 0.15±0.01 141.65±9.70 0.08±0.09組 別 例數(shù) GSH（nmol／L） GSH／GSSG CoQ10（U／L） SOD 抑制率（%） TAC（U／ml）對(duì)照組 23 0.15±0.22 2.89±2.17 1 194.50±1 760.81 83.8 2±52.70 8.59±2.05 PCOS組 25 0.13±0.15 1.84±0.75＊1 090.40±1 326.46 71.23±6.17 7.83±2.36

四、兩組臨床結(jié)局比較

對(duì)照組有15例患者獲得正常宮內(nèi)妊娠（妊娠率71.43%）、6例患者未孕，2例患者未行新鮮胚胎移植；而PCOS組（25例）共有17例患者行新鮮胚胎移植，僅有6 例患者獲得正常宮內(nèi)妊娠（妊娠率35.29%），其他7例患者未孕，4例患者妊娠結(jié)局不良（2例生化妊娠流產(chǎn)、1 例異位妊娠、1 例胚胎停育），8例未移植。PCOS組正常宮內(nèi)妊娠率顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.026）。

討 論

氧化應(yīng)激（oxidative stress，OS）指機(jī)體活性氧（ROS）產(chǎn)生過多或抗氧化能力受損而引起的一種氧化／抗氧化失衡狀態(tài)［14］。OS 對(duì)男性生殖健康的影響已有大量的研究報(bào)道［15-16］。但OS對(duì)女性卵母細(xì)胞及總體生殖功能的影響仍不十分明確［4］。近幾年，在腹膜液、卵泡液和輸卵管積水等重要的生殖微環(huán)境內(nèi)都檢測(cè)到ROS的存在［17-18］。在女性，OS的這種氧化／抗氧化失衡會(huì)引發(fā)一系列的生殖相關(guān)性疾病的發(fā)生，如：子宮內(nèi)膜異位癥、PCOS及不明原因性不孕［4］。已有研究指出，OS 可能參與PCOS的發(fā)生發(fā)展［9］，在PCOS患者中，OS可能通過誘導(dǎo)染色體和線粒體DNA 的損傷而直接降低PCOS患者的生育能力［19-20］。

本研究印證了在PCOS組基礎(chǔ)的T、LH、LH／FSH 水平均高于對(duì)照組，即高雄激素及高LH／FSH 是PCOS臨床中最常見的激素水平改變［11］。一項(xiàng)系統(tǒng)性Meta分析指出，行IVF 治療的PCOS患者的周期取消率高、獲卵率高，但臨床受精率較低［21］。而Ludwig等［22］研 究 指 出，PCOS患 者 較 對(duì)照組有較高的獲卵數(shù)、高的絕對(duì)受精卵數(shù)，MⅡ卵數(shù)無顯著性差異；并有研究指出PCOS患者高LH 水平可降低卵母細(xì)胞質(zhì)量，導(dǎo)致其流產(chǎn)率增高［23］，與本研究結(jié)果較為一致。本研究顯示，與對(duì)照組比較PCOS組有較高的獲卵數(shù)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.006），卵母細(xì)胞成熟率、受精率及IVF 優(yōu)胚率兩組間雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但PCOS組的獲卵數(shù)和絕對(duì)受精卵數(shù)是高于對(duì)照組的，而PCOS組的宮內(nèi)妊娠率（35.29%）顯著低于對(duì)照組（71.43%）。

通過檢測(cè)卵泡液中相關(guān)的氧化應(yīng)激指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)PCOS患者卵泡液中GSH／GSSG 較低，表明PCOS患者氧化應(yīng)激反應(yīng)較對(duì)照組顯著，這與Duleba等［24］指出PCOS患者的細(xì)胞因子、各種白細(xì)胞、氧化應(yīng)激指標(biāo)均處于升高水平的結(jié)論一致。Chattopadhayay等［25］研究指出，相對(duì)于輸卵管因素不孕的對(duì)照組，PCOS 組卵泡液中ROS、脂質(zhì)過氧化物（LPO）水平升高，TAC 水平降低。本研究中MDA（MDA 是LPO 中的一種）、TAC在兩組中也呈現(xiàn)出相似的趨勢(shì)，但差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中對(duì)照組妊娠結(jié)局優(yōu)于PCOS組，提示OS 狀態(tài)可能不利于妊娠。眾多研究表明，卵泡液中OS 狀態(tài)與IVF妊娠結(jié)局不良有直接關(guān)系，Das等［26］也提出卵泡液過量的ROS產(chǎn)生對(duì)卵母細(xì)胞成熟及隨后的胚胎發(fā)育均有不利影響。

Takahashi等［27］指出，GSH 是卵母細(xì)胞和胚胎發(fā)育過程中抵御自由基傷害的主要的非酶類抗氧化物。GSH 在維持卵母細(xì)胞的健康發(fā)育中占重要地位［28］。GSH 是谷?；h(huán)通路中由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸合成的一種三肽醇，有還原型（GSH）和氧化型（GSSG）兩種存在形式，GSH 在維持細(xì)胞內(nèi)還原狀態(tài)、保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激傷害中有其重要作用，GSH 在細(xì)胞和胚胎中不僅有其防御氧化損傷的作用，還起著多種重要作用，如參與DNA 合成、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞因子活化及凋亡過程［29］。本研究采用GSH／GSSG 水平來代表卵泡液中整體氧化還原狀態(tài)，以揭示其氧化應(yīng)激程度，GSH 與GSSG 為同一物質(zhì)的兩種狀態(tài)，因而認(rèn)為GSH／GSSG 比值或許優(yōu)于其他指標(biāo)，更能反映氧化應(yīng)激的氧化／抗氧化的失衡狀態(tài)。目前研究者多數(shù)用ROS、SOD、MDA、TAC 等反映氧化應(yīng)激狀態(tài)，現(xiàn)已知曉ROS包括多種分子如超氧自由基、過氧化氫、羥自由基等，每種分子都按照不同的信號(hào)通路發(fā)揮著各自的作用。而SOD 雖然作為一線抗氧化物，但體內(nèi)抗氧化物多種多樣：酶類、非酶類等，也不能以一概全。

綜上所述，相比于因輸卵管因素不孕的對(duì)照組，PCOS患者卵泡液中確實(shí)存在氧化還原失衡的氧化應(yīng)激狀態(tài)。本研究存在的不足之處在于未對(duì)所收集卵泡液的相應(yīng)卵母細(xì)胞進(jìn)行單一受精、移植過程的追蹤，本研究只用單一卵泡液的氧化應(yīng)激水平粗略代表患者的整體氧化應(yīng)激狀態(tài)，顯然有其不足之處。另有研究指出，補(bǔ)充多種維生素和礦物質(zhì)可通過加強(qiáng)機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)而降低IVF 中的氧化應(yīng)激水平［30］，而氧化應(yīng)激水平與IVF妊娠結(jié)局不良有直接關(guān)系［31-32］。通觀本研究結(jié)果，可以認(rèn)為PCOS患者體內(nèi)存在異于正常的OS狀態(tài)，而這種OS狀態(tài)與妊娠結(jié)局有關(guān)，故提示在ART 治療中若通過抗氧化治療或許可改善PCOS患者的IVF臨床結(jié)局。

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