任伯穎，康馨元，劉 冬，代婷婷，張 輝，孫佳明

(長春中醫(yī)藥大學，長春 130117)

珍珠為珍珠貝科動物馬氏珍珠貝pteriamartensii(Dunker)、蚌科動物三角帆蚌Hyriopsiscumingii(Lea)或褶紋冠蚌Cristariaplicata(Leach)等雙殼類動物[1]由于內(nèi)分泌作用而生成的含碳酸鈣的礦物珠粒。珍珠含有人體必需的氨基酸、30多種微量元素、牛磺酸、豐富的維生素及肽類[2-4]。中醫(yī)認為其具有安神定驚、明目去翳、解毒生肌等功效，陶弘景在《本草經(jīng)集》中說，珍珠“有治目膚翳，止泄”等作用。珍珠可研粉、生用，也可炮制[5]使用，王英等[6]研究發(fā)現(xiàn)，珍珠經(jīng)炮制后與珍珠未經(jīng)炮制比較鎮(zhèn)靜催眠作用有所差異，但是如何炮制珍珠才能更好的發(fā)揮珍珠的藥用價值[7-8]成為珍珠藥學研究中的又一問題。本文基于肽鍵熱振蕩理論中熱振蕩會對肽鍵三維空間結(jié)構(gòu)造成改變，使其肽類化學成分的組成發(fā)生變化，進而影響其療效的觀點出發(fā),對珍珠及其150，600，900 ℃的熱炮制品的高效液相色譜[9-11]數(shù)據(jù)進行比較，初步探討不同溫度熱炮制對珍珠中寡肽類化學成分的影響，為珍珠的加工炮制現(xiàn)代技術(shù)規(guī)范奠定基礎(chǔ)。

1 實驗材料

1.1 藥材 珍珠為安徽省太湖三角帆蚌Hyriopsis cumingii(Lea)所產(chǎn)的珍珠。

1.2 儀器 BS110S電子天平,東京理化FD-1000凍干機，電熱恒溫水浴鍋，SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵，CR20B2型冷凍高速離心機，閃式蒸發(fā)濃縮系統(tǒng)，Millipore超濾儀,固相萃取(SPE)小柱，Agilent 1100HPLC。

2 實驗方法

2.1 樣品的制備 珍珠生品的制備：將珍珠粉碎過40～60目篩。珍珠熱炮制品的制備：將珍珠生品在烘箱中分別于150，600，900 ℃烘烤1 h,取出，晾涼即得。珍珠及其熱炮制品總寡肽的制備：取珍珠生品及其熱炮制品各100 g,分別加入3倍量的水超聲2 h后，放于攪拌器下浸泡12 h，次日4 ℃下12 000 r/min離心30 min，雙層濾紙抽濾得上清液,0.45 μm微孔濾膜濾過；再用超濾儀截流分子量1 KDa以下的提取液，凍干[12]。取凍干粉0.25g加入雙蒸餾水溶解后，經(jīng)C8固相萃取柱純化,先2 mL蒸餾水淋洗后再用2 mL 50%甲醇洗脫，洗脫液過0.45 μm濾膜，備用。

2.2 色譜條件 XAqua C8色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)，0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫：0～10 min，A相10%→15%；10～20 min，A相15%→45%。進樣量為10 μL，流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，洗脫時間為20 min，檢測波長280 nm。

3 實驗結(jié)果

3.1 珍珠及其熱炮制品總寡肽的高效液相色譜圖中色譜峰數(shù)目的比較 實驗結(jié)果表明，乙腈/0.1%的甲酸水溶液二元線性梯度洗脫，珍珠及其熱炮制品中的寡肽類化學成分得到了較理想的分離效果，見圖1。

A:生品；B:150 ℃烘烤品；C:600 ℃烘烤品；D:900 ℃烘烤品圖1 不同溫度熱炮制珍珠寡肽類成分的高效液相色譜圖

通過4種樣品高效液相色譜圖的比較分析，發(fā)現(xiàn)對珍珠及其熱炮制品中均含2個共有色譜峰，分別為峰4和峰8。但是各樣品的高效液相色譜圖中所含色譜峰數(shù)目并不一致，這說明它們含有的寡肽類化學成分的種數(shù)量各不相同。其中生品和900 ℃烘烤品中所含色譜峰數(shù)目最少，為4個；而150 ℃和600 ℃烘烤品中所含色譜峰數(shù)目最多,分別為7個和9個。這說明珍珠在熱炮制過程中，隨著炮制在一定范圍內(nèi)(150～600 ℃)隨著溫度的提高,所得到的寡肽類化學成分的數(shù)目也隨之增加。但是當溫度高于一定范圍(≥900 ℃)，其中的寡肽化學成分多數(shù)遭到破壞，未能提取得到。

3.2 珍珠及其熱炮制品總寡肽的高效液相色譜圖中色譜峰峰面積的比較 珍珠的熱炮制品中的共有峰(峰4和峰8)的峰面積相對于珍珠生品中對應(yīng)的色譜峰的峰面積均有不同程度的減少，這說明珍珠的熱炮制品中寡肽類化學成分含量相對于珍珠生品有不同程度的下降，見表2。

表2 珍珠生品及其熱炮制品中寡肽類化學成分的色譜峰峰面積

編號保留時間/min紫外特征Uvmax峰面積生品150 ℃600 ℃900 ℃ 1 7.697270 — — 6.217.7 2 8.036280 34.6 — 90.331.6 3 8.575280 12.9 15.1 8.7 — 410.343260372.5 37.229.7 23.3 510.809260 — —12.24 — 611.146260 — 8.8 12.4 — 711.581260 —206.7189.9 — 815.134260270.8 128 68.164.6 915.208260 — — 46.8 —1016.146260 — 73.9 — —

4 結(jié)論

通過珍珠及其熱炮制品總寡肽高效液相色譜峰面積數(shù)據(jù)的分析,發(fā)現(xiàn)4種樣品中共有峰峰4和峰8的峰面積隨著熱炮制溫度的升高而逐漸下降。150，600，900 ℃烘烤下的珍珠高效液相色譜圖的峰4的峰面積依次下降為生品的9.99%、7.97%和6.26%，而150，600,900 ℃烘烤下的珍珠中高效液相色譜圖的峰8的峰面積依次下降為生品的47.3%、25.1%和23.9%。由此可以看出峰4和峰8對應(yīng)的化學成分的熱穩(wěn)定性有一定差異，即在相同的肽鍵熱振蕩程度下,肽鍵的牢固程度峰8大于峰4。故而在熱炮制過程中峰8對應(yīng)的化學成分保留的相對于峰4要多出3到4倍。

在一定范圍內(nèi)(150～600 ℃)隨著熱炮制溫度的提高,珍珠及其熱炮制品總寡肽高效液相色譜圖中峰4和峰8的峰面積隨之逐漸下降。同時熱炮制品中的寡肽類化學成分的數(shù)目卻逐漸增加，這有可能峰4或峰8對應(yīng)的寡肽類成分中肽鍵在熱振蕩的作用下產(chǎn)生裂解，新生成了更多的更小分子量的寡肽類化學成分。但是當溫度高于一定范圍(≥900 ℃)，其中的寡肽化學成分的肽鍵由于熱振蕩作用過強烈而多數(shù)遭到破壞，未能提取得到。

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