白 甫，朱麗紅，柳小莉，唐志書，郭東艷

(陜西中醫(yī)學院藥學院，陜西 咸陽 712046)

花生衣為豆科植物落花生(ArachishypogaeaL.)的種皮，味甘、微苦、性平，具有健脾和胃、養(yǎng)血止血、散瘀消腫之功。主要含有脂質、鞣質、甾醇、花生苷、花生衣色素、兒茶素等成分[1]，其中主要色素成分為黃酮類化合物，另外還含有花色苷、黃酮、二氫黃酮等?，F代藥理研究表明，花生衣的95% 乙醇總提物對正常小鼠及凝血障礙小鼠均有明顯的止血作用[2]。此外花生衣還具有抗纖維蛋白溶解、促進骨髓制造血小板、縮短出血時間、加強毛細血管的收縮、調整凝血因子缺陷等功能[3]。臨床觀察結果表明花生衣湯能提高化療周期患者的血紅蛋白[4]、顯著提高肝硬化患者的血小板數[5]及具有防止化療引起血小板降低的作用[6]。近年來廣泛用于胃、腸、肺、子宮等內臟出血，及放化療引起的血小板減少癥等。但是查閱大量文獻資料發(fā)現，有關花生衣總黃酮純化工藝研究較少，因此本文擬采用大孔樹脂純化法對花生衣總黃酮的純化工藝進行優(yōu)化，為后期進一步制劑開發(fā)奠定基礎。

1 實驗材料

1.1 材料 花生衣購于西安盛興中藥飲片有限公司，經陜西中醫(yī)學院王繼濤老師鑒定為豆科植物落花生(ArachishypogaeaL.)的種皮；蘆丁對照品(中國生物制品檢定所，批號100080-200707),水為雙蒸餾水，試劑均為分析純；D101型大孔樹脂、HPD300型大孔樹脂、HPD100型大孔樹脂、AB-8型大孔樹脂(西安藍曉科技有限公司)。

1.2 儀器 WJN-50多功能真空濃縮機(韓國)，L-520型離心機(湖南賽特湘儀離心機有限公司)，RE-52-05旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠),SB3200DT-超聲波清洗機(寧波)。

2 實驗方法與結果

2.1 總黃酮含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取在105 ℃干燥至恒重的蘆丁對照品10.0 mg，置50 mL量瓶中，加20 mL甲醇，超聲處理溶解，再用甲醇定容至刻度，搖勻，即得對照品溶液(0.20 mg/mL)，放入冰箱備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密移取樣品液1 mL至50 mL量瓶中,加50%甲醇至刻度。精密吸取0.5 mL至25 mL量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 總黃酮的最大吸收波長的確定 分別對對照品溶液和供試品溶液進行最大吸收波長掃描，掃描范圍200～800 nm，結果均在510 nm處有強吸收峰。

2.1.4 標準曲線的制備 精密量取對照品溶液2，3，4，5，6，7 mL，分別置25 mL量瓶中，各加水至6.0 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應的試劑為空白，參照紫外-可見分光光度法(附錄ⅤA)在510 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(Y)，濃度為橫坐標(X)，繪制標準曲線。 得回歸方程Y=11.339X-0.035，R2=0.999 7，結果表明蘆丁在0.016～0.056 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.5 樣品中總黃酮含量測定 精密吸取供試品溶液1 mL，加水至6.0 mL，按2.1.4項下加5%亞硝酸鈉溶液1 mL起，至在510 nm波長處測定吸光度，記錄吸光度，計算總黃酮含量。

2.2 樹脂型號的篩選

2.2.1 母液的制備 稱取花生衣1 kg，加15倍量40%乙醇提取3次，每次30 min,濾過合并提取液，濃縮，回收乙醇至無醇味，加蒸餾水定容至2 000 mL，備用。

2.2.2 樣品溶液的制備 取母液100 mL，加蒸餾水定容至250 mL，制成濃度為0.2 g/mL樣品。

2.2.3 大孔吸附樹脂的預處理 用95%的乙醇浸泡24 h，蒸餾水洗至無醇味，備用。

2.2.4 靜態(tài)吸附 將經過預處理的4種大孔樹脂(D101、HPD100、HPD300、AB-8)去除表面水后，各取3 g，分別置于具塞錐形瓶中，再分別移取0.2 g/mL的樣品溶液50 mL加入裝有樹脂的具塞錐形瓶中，振搖8 h，靜置16 h，過濾，得殘留液。測定總黃酮含量A1。樹脂加入50%的乙醇50 mL,振搖8 h，靜置16 h，過濾，得到洗脫液，測定總黃酮含量A2。

2.2.5 液殘留液及洗脫液中總黃酮的測定 母液中總黃酮的測定：取1 mL樣品溶液，用甲醇定容至25 mL，取出0.4 mL，加入顯色劑，定容至25 mL。測定母液中的總黃酮含量A3,結果見表1。

未被吸附的殘留液中與洗脫液中總黃酮含量的測定：精密吸取殘留液與洗脫液各1 mL，用甲醇定容至25 mL，取出0.8 mL加顯色劑定容至25 mL。測定其殘留液中總黃酮含量A1，洗脫液中總黃酮含量A2，結果見表1。

吸附率=[(母液含量A3(mg)-殘留液中總黃酮含量A1(mg))/母液含量A3(mg)]×100%

解析率=[40%乙醇洗脫下的含量A2/(母液含量A3(mg)-殘留液中含量A1(mg))]×100%

表1 靜態(tài)吸附考察結果

結果表明:AB-8型大孔樹脂的吸附量、解吸量低于其他3種型號樹脂，D101的吸附率及解吸率較大，故選擇D101樹脂。

2.3 樹脂純化條件的考察[7-8]

2.3.1 徑高比的選擇 分別稱取預處理過的D101大孔樹脂2.4，4.8，7.2，9.6 g,使徑高比分別為1∶5,1∶10,1∶15,1∶20。樹脂生藥比為1∶1。分別取適量的樣品溶液稀釋至濃度為0.1/mL,加于D101樹脂柱上，以3 BV/h的流速進行吸附，先以4 BV水洗脫后，再用4BV 70%乙醇洗脫，收集洗脫液，測定水洗液和醇洗液中總黃酮的含量,計算吸附率及洗脫率。結果當徑高比為1∶15時,花生衣的吸附率和洗脫率均最大，因此，確定樹脂柱的徑高比為1:15。

2.3.2 上樣藥液濃度的選擇 稱取預處理過的D101大孔樹脂4份，每份7.2 g，使徑高比為1∶15。樹脂生藥比為1∶1，分別取適量的樣品溶液,將樣品溶液分別稀釋為含生藥0.1,0.2,0.3,0.4 g/mL,(原本考察的濃度為0.2，0.4，0.6，0.8 g/mL，但由于濃度到0.4 g/mL時。柱子有些堵，所以將濃度范圍定為0.1，0.2，0.3，0.4 g/mL)，加于D101樹脂柱上，以3 BV/h的流速進行吸附后，先以4 BV/h水洗脫后，再用4 BV/h 70%乙醇洗脫，收集洗脫液至，計算吸附率及洗脫率。結果見表2。

表2 上樣藥液濃度的考察結果

在從表中可以看出上樣藥液濃度為0.1 g/mL時，花生衣中總黃酮的吸附率和洗脫率均最大，因此，確定上樣液的藥液濃度為0.1 g/mL。

2.3.3 上樣藥液流速的考察 稱取D101樹脂7 g 4份，分別裝柱，徑高比為1∶15，取0.1 g/mL的藥液50 mL 4份。將4份樣品分別按照0.5,1,2,3 BV/h的流速上樣，統一按照50 mL水洗量，2 BV/h水洗流速進行水洗除雜,70%乙醇洗脫至鹽酸鎂粉反應無色。分別收集洗脫，取1 mL用甲醇定容至25 mL，精密量取0.8 mL，加顯色劑定容至25 mL。結果見表3。

表3 上樣藥液流速考察結果

結果表明：上樣流速對有效成分的吸附有顯著的影響，在2 BV/h的條件下有效成分含量最大，故確定上樣流速為2 BV/h。

2.3.4 水洗大孔樹脂的考察 取已經過預處理的大孔樹脂7.2 g裝柱(1.1 cm×15 cm，V=3.14×(1.1/2)2×15=14.25)，取上樣藥液72 mL(0.1 g/mL)藥液上樣后靜置2 h,以流速為2 BV/h的水除去水溶性雜質。以15 mL為單位收集洗脫液，洗至無顏色。以鹽酸鎂粉反應陰性作為水洗終點，最終確定洗脫用水用量約3 BV。

2.3.5 洗脫劑濃度的確定 取已經過預處理的大孔樹脂裝柱(1.1 cm×15 cm,V=3.14×(1.1/2)2×15=14.25)，取上樣藥液72 mL(0.1 g/mL)。藥液上樣后靜置2 h，用3 BV水洗去雜質后,依次用10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液各3 BV進行梯度解吸，分段收集解吸液。測定并計算解吸液中黃酮的含量，繪制解吸曲線，結果見圖1。

圖1 洗脫劑濃度考察結果

由圖可以看出，黃酮在60%時基本解析完畢，但由于在解吸的過程中乙醇會揮發(fā),所以選擇70%的乙醇為洗脫劑。

2.3.6 洗脫劑用量的考察 取已經過預處理的大孔樹脂裝柱(1.1 cm×15 cm，V=3.14×(1.1/2)2×15=14.25)，取上樣藥液72 mL(0.1 g/mL生藥)藥液上樣后靜置2 h，用3 BV水洗去雜質后，用70%乙醇進行洗脫，每1 BV收集1份，測定洗脫液中總黃酮的含量，繪制解析曲線。結果見圖2。

圖2 洗脫液用量考察試驗結果曲線

結果表明：當洗脫劑用量達到3 BV時，洗脫液中的黃酮含量已很低。所以選擇洗脫劑用量為3 BV。

2.4 花生衣大孔樹脂的工藝參數驗證 按照優(yōu)選的工藝條件，選用D101型大孔樹脂，上樣藥液濃度為0.1 g/mL，上樣速度為2 BV/h，樹脂徑高比為1∶15，洗脫時先用3 BV水洗，再用3 BV 70%乙醇洗脫，收集洗脫液，干燥，計算總黃酮含量。結果總黃酮平均含量為66.12%(n=3)。表明該純化工藝穩(wěn)定、合理、可行。

3 結論

大孔樹脂吸附法是近年來中藥及天然藥物純化工藝中應用較為廣泛的一種方法。由于其價格便宜，可重復使用，且所得到的的純化物色澤較淺，吸濕性降低，特備適宜于中藥提取液的分離純化。故本文采用其對花生衣的總黃酮進行純化精制，為后期制劑成型奠定基礎。

本文通過建立紫外-可見分光光度法對花生衣總黃酮進行含量測定，通過D101型大孔吸附樹脂對總黃酮分離富集條件進行了優(yōu)化優(yōu)化，確定了其分離富集條件。經純化后花生衣總黃酮純度達到66.12%，分離效果良好該工藝具有操作簡單、重復性好等優(yōu)點,具有較好的推廣應用。

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