張亞楠，王世軍

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)國際教育學(xué)院，濟(jì)南 250355)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一種非器質(zhì)性的腸道功能紊亂性疾病，其主要臨床表現(xiàn)是腹部不適或腹部疼痛同時(shí)伴有排便習(xí)慣及糞便性狀的改變[1]。羅馬Ⅲ診斷標(biāo)準(zhǔn)和我國對(duì)IBS共識(shí)意見的更新使IBS成為研究的熱點(diǎn),但I(xiàn)BS的病因和發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚,對(duì)其機(jī)制的研究也未達(dá)成共識(shí)?，F(xiàn)在很多研究普遍認(rèn)為IBS的發(fā)病是多因素綜合作用的結(jié)果，已知的一些因素如腸道動(dòng)力異常、精神心理異常、內(nèi)臟感覺異常、植物神經(jīng)功能紊亂、胃腸激素分泌異常、腦-腸軸學(xué)說、應(yīng)激、腸道感染等都與腸易激綜合征的發(fā)生密切相關(guān)[2]，IBS的發(fā)生直接受到中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的影響。國內(nèi)外研究表明[3-5]內(nèi)臟高敏性是IBS發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，調(diào)節(jié)IBS患者內(nèi)臟感覺可能為IBS的治療帶來新途徑。 降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin generelated peptide，CGRP)是胃腸道感覺信息傳遞的重要遞質(zhì)，在腸神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，CGRP主要分布于黏膜下叢的初級(jí)傳入神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，傳遞腸腔或腸壁的各種物理性和化學(xué)性刺激信號(hào)，參與調(diào)節(jié)胃腸道的功能活動(dòng)[6-7]。P物質(zhì)(SP)作為胃腸肽類激素和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在消化系統(tǒng)的分泌和運(yùn)動(dòng)中起著十分重要作用,并且SP在IBS發(fā)病因素的腸道感染、神經(jīng)免疫內(nèi)分泌、應(yīng)激、內(nèi)臟敏感性增高等機(jī)制中均發(fā)揮重要作用。在前期的研究中發(fā)現(xiàn)電針治療可以改善IBS的糞便性狀，降低IBS模型大鼠血漿CGRP和SP的表達(dá)[8]。為了進(jìn)一步了解CGRP和SP在電針治療IBS中的作用，本研究通過建立便秘型IBS大鼠模型，觀測(cè)電針對(duì)大鼠結(jié)腸組織中CGRP和SP基因表達(dá)的影響，從而探討CGRP和SP在電針治療便秘型IBS中的作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性Wistar大鼠32只,SPF級(jí)，體質(zhì)量(180±20)g，購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，許可證號(hào)為SCXK(魯)20080002。飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，恒定溫度濕度，室內(nèi)溫度控制在20～25 ℃。動(dòng)物自由攝食及飲水。實(shí)驗(yàn)前1周動(dòng)物予以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境，自由進(jìn)食與飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和器材 韓氏疼痛治療儀(HANS-100A)，南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司；毫針(規(guī)格0.30 mm×15 mm)，蘇州環(huán)球針灸醫(yī)療器械有限公司；臺(tái)式高速低溫離心機(jī)(LEGEND MICRO 21R)，Thermo；7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國Applied biosystems公司。RNA提取試劑盒TRIzol Reagent，Invitrogen公司；SuperScript III RT kit，Invitrogen公司；1kb Plus DNA Ladder，Invitrogen公司；UltraPure Agarose，Takara公司；Platinum Taq DNA Polymerase，Invitrogen公司；10 mmol dNTP Set，Invitrogen公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及造模 將32只Wistar大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組和實(shí)驗(yàn)組，正常組(C-N組)8只，實(shí)驗(yàn)組模型制備成功后隨機(jī)分為模型組(C-M組)、電針上巨虛組(C-DS組)、電針大腸俞組(C-DD組)，每組8只。正常組大鼠每日給予26～28 ℃生理鹽水2 mL灌胃1次，實(shí)驗(yàn)組模型大鼠每日給予0～4 ℃生理鹽水2 mL灌胃1次，共14 d[9]。正常組與實(shí)驗(yàn)組除灌胃外均給予正常飲食，為消除生物節(jié)律的影響，每日灌胃均于上午8：30開始。

2.2 取穴及針刺 參照李忠仁等主編的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜定位，上巨虛穴位于大鼠后肢足三里向下約5 mm處;大腸俞位于腰部，當(dāng)?shù)?腰椎棘突下，旁開5 mm。造模成功后，將C-DS組和C-DD組的大鼠捆綁、束縛，取雙側(cè)的穴位，直刺進(jìn)針約5 mm，穴位旁開5 mm平刺，接電針，電針參數(shù)為:疏密波，頻率2/100 Hz，強(qiáng)度0.1～0.2 mA，以皮膚肌肉或針柄微微顫動(dòng)但大鼠不產(chǎn)生嘶叫為度。造模成功后開始電針治療，1次/d，每次30 min,連續(xù)7 d。C-M組只捆綁束縛30 min，不針刺。C-N組不進(jìn)行任何處理。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)腸CGRP、SP mRNA的表達(dá) 治療結(jié)束后，用10%水合氯醛4 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，在冰塊上迅速取出大鼠的結(jié)腸，放置于-80 ℃冰箱保存。所有試驗(yàn)器材都經(jīng)過滅活RNA酶處理。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定結(jié)腸中CGRP、SP mRNA的表達(dá)，以TRIzol試劑提取結(jié)腸組織標(biāo)本總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。GAPDH作為CGRP、SP的內(nèi)參，二者均通過2-△△Ct法分析基因相對(duì)表達(dá)量。2-△△Ct相對(duì)定量分析的結(jié)果判斷:循環(huán)閾值(△Ct)=樣品Ct均值-內(nèi)參照Ct均值，△△Ct=△Ct-(隨機(jī)陰性對(duì)照樣品Ct均值-該樣品內(nèi)參照Ct均值)。

實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)引物為：CGRP上游引物5’-TGCCCAGATCAAGAGTCACC-3’，下游引物5’-GTAGAACGACCCACCTGAGC -3’;SP上游引物5’-GAGCAGCGTGTACAAGGTCA -3’，下游引物5’-CCCAGTGCTAGGGTATTCCA-3’；GAPDH上游引物5’-CTTAGCACCCCTGGCCAAG-3’，下游引物5’-GATGTTCTGGAGAGCCCCG-3’。標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增條件為:95 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s共40個(gè)循環(huán)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 電針對(duì)C-IBS大鼠CGRP mRNA表達(dá)的影響 電針治療結(jié)束后，各組大鼠結(jié)腸CGRP mRNA相對(duì)表達(dá)量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與C-N組相比，C-M組結(jié)腸組織CGRP mRNA的表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；C-DD組、C-DS組結(jié)腸組織CGRP mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與C-M組相比，C-DS組結(jié)腸組織CGRP mRNA表達(dá)水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而C-DD組與C-DS組之間結(jié)腸組織CGRP mRNA表達(dá)水平未表現(xiàn)出明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。以上結(jié)果說明，C-IBS中結(jié)腸組織中CGRP激活，電針刺激可以降低結(jié)腸組織CGRP mRNA的表達(dá)。結(jié)果見表1。

表1 C-IBS各組大鼠結(jié)腸CGRP mRNA比較

注：與正常組相比較，##P<0.01；與模型組相比較，△△P<0.01

3.2 電針對(duì)C-IBS大鼠SP mRNA表達(dá)的影響 電針治療結(jié)束后，各組大鼠結(jié)腸SP mRNA相對(duì)表達(dá)量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與C-N組相比，C-M組結(jié)腸組織SP mRNA的表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；C-DD組、C-DS組結(jié)腸組織SP mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與C-M組相比，C-DD組、C-DS組結(jié)腸組織SP mRNA表達(dá)水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.01)。C-DD組與C-DS組之間結(jié)腸組織SP mRNA表達(dá)水平未表現(xiàn)出明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。以上結(jié)果說明，C-IBS中結(jié)腸組織中SP激活，電針刺激可以降低結(jié)腸組織SP mRNA的表達(dá)。結(jié)果見表2。

表2 C-IBS各組大鼠結(jié)腸SP mRNA比較

注：與正常組相比較，##P<0.01;與模型組相比較，△△P<0.01

4 討論

腸易激綜合征是一種非器質(zhì)性的腸道功能紊亂性疾病，隨著生活節(jié)奏的加快、工作壓力的增大和社會(huì)競爭壓力的增加,IBS的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。在中醫(yī)學(xué)中腸易激綜合征沒有特定的病名，根據(jù)臨床特征如腹瀉、腹痛、便秘和患者精神的癥狀，而歸屬于“泄瀉”“腹痛”“便秘”及“郁癥”等病癥范疇[10]。

IBS的患者越來越年輕化，盡管對(duì)IBS的藥物治療、心理學(xué)相關(guān)治療研究較多，但由于IBS不同亞型間臨床癥狀和對(duì)藥物反應(yīng)的差別，故迄今為止沒有一種對(duì)所有IBS病人均有效的藥物，對(duì)IBS的治療多以對(duì)癥為主，單一藥物作用局限,難以滿足臨床需要。針灸作為中醫(yī)的獨(dú)特療法，在消化系統(tǒng)疾病方面的運(yùn)用日趨廣泛，被全世界的醫(yī)生和患者接受和認(rèn)可[11]。針刺對(duì)胃腸道具有良性調(diào)整作用，使失常的腸道運(yùn)動(dòng)機(jī)能趨向正?；瑫r(shí)對(duì)神經(jīng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)也有明顯的調(diào)整作用。針刺治療IBS具有療效確切，毒副作用少的優(yōu)點(diǎn)，但針刺治療IBS的機(jī)制尚未完全闡明。

林慶等[12]取中脘、下脘、氣海、關(guān)元、天樞等穴位治療C-IBS患者，針灸治療組的總有效率為95.9%，且作用持久、不易復(fù)發(fā)。楊秀麗等[13]以取大腸經(jīng)、募穴及下合穴為主，針灸并用,治療便秘型IBS患者72例。對(duì)照組30例患者給予麻仁軟膠囊治療。3個(gè)月之后，2組的總有效率均為100%。以上研究表明，針灸或電針治療IBS取得了良好的效果，可以緩解IBS患者的腹痛、腹脹，改變糞便性狀，而且針灸或電針治療能降低IBS患者的內(nèi)臟高敏感性[14-15]。

CGRP是目前公認(rèn)的與傷害性信息傳導(dǎo)密切相關(guān)的神經(jīng)活性物質(zhì)，一些研究發(fā)現(xiàn)存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腸道感覺神經(jīng)的CGRP在內(nèi)臟疼痛的調(diào)節(jié)中起重要作用[16]，作為神經(jīng)調(diào)節(jié)介質(zhì)，CGRP可通過調(diào)節(jié)局部血流、平滑肌收縮、肥大細(xì)胞脫顆粒等改變內(nèi)臟感覺的傳入信號(hào),這可能是導(dǎo)致IBS腸道動(dòng)力異常和腹痛的原因。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠結(jié)腸組織中CGRP mRNA水平較正常組顯著升高，而電針治療組則較模型組明顯降低。推測(cè)認(rèn)為：電針能通過對(duì)C-IBS模型大鼠結(jié)腸CGRP基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，發(fā)揮調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌及胃腸道運(yùn)動(dòng)的作用，并改善內(nèi)臟敏感狀態(tài)。

SP屬于速激肽家族，含有11個(gè)氨基酸殘基，是一種發(fā)現(xiàn)最早的神經(jīng)肽，主要分布于腸肌間神經(jīng)叢和黏膜下神經(jīng)叢，儲(chǔ)存在細(xì)的初級(jí)傳入神經(jīng)纖維中，在細(xì)纖維受到刺激時(shí)可在傳入神經(jīng)的中樞和外周端末梢釋放，參與痛覺信息的傳遞。另一方面通過與其高親和力受體結(jié)合對(duì)靶細(xì)胞發(fā)揮生物效應(yīng)，可以調(diào)節(jié)胃腸道動(dòng)力、刺激腺體的分泌、增加血管滲透性以及疼痛刺激的敏感性。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠結(jié)腸組織中SP mRNA水平較正常組顯著升高，而電針治療組則較模型組明顯降低。推測(cè)認(rèn)為：C-IBS患者腸黏膜SP含量增高，可能與便秘型IBS痛覺過敏有關(guān)。電針可能以通過降低SP含量,減弱背角神經(jīng)元興奮性，從而提高內(nèi)臟痛閾，消除腸道過敏。

但是CGRP和SP是否是電針治療的主要作用途徑及是否存在其他作用途徑尚待進(jìn)一步研究探討證實(shí)。無疑，闡明這些問題將對(duì)電針治療C-IBS的機(jī)制提供更多科學(xué)依據(jù)。

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