宋昌玲,唐啟盛,趙瑞珍,王雯龍,朱明瑾

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029)

焦慮癥是一類以恐懼、擔(dān)憂、緊張不安等焦慮情緒為核心癥狀的神經(jīng)癥，主要包括急性發(fā)作的驚恐障礙(Panic disorder，簡稱PD)和慢性病程的廣泛性焦慮障礙(generalized anxiety disorder,簡稱GAD)[1]。隨著現(xiàn)代社會生活節(jié)奏的加快，GAD的發(fā)病日趨普遍。其慢性病程、易復(fù)發(fā)、影響生活質(zhì)量等特點，對人類身心健康的危害較大,因而對GAD的發(fā)病機制、防治措施開展深入研究極具必要性和緊迫性。本研究用環(huán)境相關(guān)恐懼應(yīng)激方法建立廣泛性焦慮大鼠模型，并通過對大鼠行為學(xué)變化的觀察、測評，對中藥疏肝清熱健脾法的干預(yù)作用進行探討。

1 實驗材料

健康Wistar雄性大鼠48只，SPF級，10周齡，體質(zhì)量(200±10) g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號:SCXK(京)2010-0001。動物購進后飼養(yǎng)于SPF級實驗動物中心，自由攝食飲水，光照節(jié)律12L/12D(6:00～18:00)，室溫(20±2) ℃，相對濕度50%～60%，保持安靜。高架十字迷宮(開放臂50 cm×10 cm，閉合臂50 cm×10 cm×40 cm，中央?yún)^(qū)10 cm×10 cm)由上海欣軟信息科技有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品型號為:XR-XG201。Xmaze實驗動物行為學(xué)視頻分析系統(tǒng)，由上海欣軟信息科技有限公司生產(chǎn)，與高架十字迷宮設(shè)備配套。聲電刺激儀,由上海軟隆科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)。丹梔逍遙散(柴胡15 g，梔子10 g，牡丹皮10 g，炒白術(shù)15 g等)購于北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，造模前按大鼠用量10.5 g/(kg·d)，灌胃劑量每次2 mL煎煮，煎取后濃縮至生藥濃度1.05 g/mL，貯存于4 ℃冰箱冷藏備用，灌胃前以溫水隔水加熱。鹽酸丁螺環(huán)酮(商品名:一舒，江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，批準文號:國藥準字H19991024)，按成人用量20 mg/(70 kg·d)的7倍、灌胃劑量每次2 mL計算大鼠用量2.0 mg/(kg·d)，以濃度0.20 mg/mL溶于蒸餾水中，灌胃前混勻。

2 實驗方法

2.1 動物分組與給藥 動物預(yù)養(yǎng)1周后，首先將48只動物進行曠場試驗,以水平運動總格數(shù)與直立次數(shù)(垂直運動)之和為參考，按正態(tài)分布去掉置信區(qū)間95%以外的大鼠8只，剩余40只大鼠按水平運動與垂直運動之和隨機分為正常組、模型組、對照組、治療組，每組10只。自造模第1天起,正常組不予任何處理，自由攝食、飲水，模型組予以蒸餾水灌胃，對照組予以丁螺環(huán)酮水溶液灌胃，治療組予以中藥丹梔逍遙散濃縮藥汁灌胃，連續(xù)21 d。

2.2 模型制備 動物預(yù)養(yǎng)及分組結(jié)束后，模型組、對照組、治療組與灌胃同步進行環(huán)境相關(guān)恐懼模型的制備。本模型制備分3個階段進行應(yīng)激，第1階段為條件性訓(xùn)練(1 d)，給予大鼠條件性刺激，程序為“無刺激180 s→聲音信號30 s→足底電擊2 s→無刺激20 s”，訓(xùn)練10次；第2階段為環(huán)境相關(guān)(2 d)，將大鼠放入第一階段環(huán)境中，評價環(huán)境相關(guān)的條件性恐懼程度，程序為“無刺激180 s”；第3階段為改變的環(huán)境信息(2 d)，改變環(huán)境信息后觀察大鼠的條件性恐懼程度，程序為“無刺激180 s→聲音信號180 s→無刺激6 s”。以上流程循環(huán)4次，共20 d。聲電刺激儀設(shè)定電流為1.2 mA，聲音信號采用“滴滴”樣相同頻率聲音。模型制備同時，觀察并記錄大鼠僵滯時間,僵滯時間記錄由3名觀察者觀察結(jié)果平均而得。模型制備期間，3組大鼠的應(yīng)激操作于每天8:00～11:30進行，應(yīng)激前大鼠提前30 min進入應(yīng)激實驗室適應(yīng)環(huán)境，操作時抓取動物輕柔。

2.3 高架十字迷宮測試 行為學(xué)實驗室保持安靜通風(fēng)，恒溫22 ℃,濕度50%～60%，室內(nèi)暗光，光線自天花板反射到高架十字迷宮測試區(qū)。迷宮由兩個開放臂(50 cm×10 cm)、兩個封閉臂(50 cm×10 cm×40 cm)、一個連接四臂的中央平臺(10 cm×10 cm)組成,開放臂與封閉臂互相垂直成十字形。測試前動物提前60 min進入房間適應(yīng)環(huán)境，測試時實驗人員輕柔抓取大鼠并迅速輕放入EPM中央平臺處，放置時使大鼠頭部正對其中一個開放臂,每只大鼠測試時間5 min，各組交叉進行，測試時攝像視頻系統(tǒng)記錄大鼠行為表現(xiàn)，實驗人員可通過顯示器觀察大鼠迷宮上的活動，每只大鼠測試結(jié)束后將排泄物清除干凈，并以酒精擦拭迷宮底部，以免影響下只大鼠行為表現(xiàn)。高架十字迷宮測試于造模結(jié)束次日15:00～18:00進行，所有大鼠測試結(jié)束后，統(tǒng)一分析視頻，記錄并整理大鼠進入開放臂次數(shù)、進入開放臂時間、進入封閉臂次數(shù)、進入封閉臂時間、探頭次數(shù)、直立次數(shù)、修飾次數(shù)、排便次數(shù),并計算進入開放臂與封閉臂次數(shù)之和、開放臂次數(shù)占總次數(shù)百分比、開放臂時間占總時間百分比。

3 實驗結(jié)果

3.1 造模期間恐懼消退觀察 模型制備過程中，模型組、對照組、治療組在每個流程中均表現(xiàn)出電擊刺激撤除后的恐懼消退,模型組、對照組、治療組僵滯時間占總時間百分比第2，7，12，17天組間比較無差異;對照組僵滯時間占總時間百分比第4，5，8，9，10，13，14，15，18，19，20天比模型組減少(P<0.05，P<0.01)，治療組僵滯時間占總時間百分比第8，9，10，13，14，15，18，19，20天比模型組減少(P<0.05，P<0.01)；治療組僵滯時間占總時間百分比與對照組比較，第2，3，4，7，12，15，17，18，19，20天差異無統(tǒng)計學(xué)意義,第5，8，9，10，13，14天治療組高于對照組(P<0.05，P<0.01)。對照組從第1個流程開始(第4天起)表現(xiàn)出僵滯時間較模型組有差異,治療組從第2個流程開始(第8天起)僵滯時間較模型組有差異。結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠恐懼消退折線圖

圖2 環(huán)境相關(guān)恐懼模型大鼠體質(zhì)量變化折線圖

模型組、對照組、治療組組內(nèi)僵滯時間占總時間百分比流程間的比較顯示：第2，7，12，17天(即每個流程第2天)、第3，8，13，18天(即每個流程第3天)、第4，9，14,19天(即每個流程第4天)及第5，10，15，20天(即每個流程第5天)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

3.2 造模結(jié)束后一般情況及體質(zhì)量變化觀察 造模結(jié)束后肉眼觀察4組大鼠神態(tài)、毛發(fā)、飲食、糞便性狀，結(jié)果見模型組、對照組、治療組大鼠較正常組大鼠神態(tài)懶倦，毛發(fā)無光澤，飲食欠積極，活動欠活躍，易激惹，少數(shù)大鼠見溏便。且3組大鼠與正常組大鼠對比之差別以模型組尤甚，對照組及治療組次之。造模第1，2，3天4組大鼠體質(zhì)量無差異，自第4天起至造模結(jié)束，正常組與模型組、對照組、治療組比較有差異(P<0.05，P<0.01)，其中自第8天起差異明顯，正常組高于其余3組(P<0.01)。對照組與模型組第9天起至造模結(jié)束有差異，對照組高于模型組(P<0.05,P<0.01)，治療組與模型組第7天起至造模結(jié)束有明顯差異,治療組高于模型組(P<0.01)。治療組與對照組比較第9天起至造模結(jié)束有差異，治療組高于對照組(P<0.05，P<0.01)，且第13天起至造模結(jié)束有明顯差異(P<0.01)。結(jié)果見圖2。

3.3 高架十字迷宮測試 與正常組比較，模型組、對照組、治療組開閉臂活動總次數(shù)、開臂活動次數(shù)所占比例、開臂活動時間所占比例均減少(P<0.05，P<0.01)。對照組開閉臂活動總次數(shù)、開臂活動次數(shù)所占比例、開臂活動時間所占比例比模型組增多(P<0.05，P<0.01)。治療組開閉臂活動總次數(shù)、開臂活動次數(shù)所占比例、開臂活動時間所占比例比模型組明顯增多(P<0.01)。治療組開閉臂活動總次數(shù)、開臂活動次數(shù)所占比例、開臂活動時間所占比例與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見表1。

組 別開、閉臂活動總次數(shù)開臂活動次數(shù)所占比例/%開臂活動時間所占比例/%正常組11.00±1.48 0.36±0.03 0.23±0.01 模型組 7.10±0.83## 0.27±0.03## 0.16±0.01## 對照組 8.90±1.64#△△0.30±0.03##△0.20±0.01##△△治療組 9.20±1.66#△△0.33±0.04#△△0.21±0.01##△△

注：與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01

與正常組比較，模型組、對照組、治療組探頭、直立次數(shù)均減少(P<0.05，P<0.01)，修飾、排便次數(shù)比正常組增多(P<0.05，P<0.01)；對照組探頭、直立次數(shù)比模型組增多(P<0.05，P<0.01)，修飾、排便次數(shù)比模型組減少(P<0.05)；治療組探頭、直立次數(shù)比模型組明顯增多(P<0.01),修飾、排便次數(shù)比模型組減少(P<0.05)；治療組探頭、直立、修飾、排便次數(shù)均與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見表2。

組 別探頭次數(shù)直立次數(shù)修飾次數(shù)排便次數(shù)正常組12.30±1.55 12.40±1.43 4.30±1.00 1.10±0.70 模型組 6.80±1.47## 8.70±1.42## 6.90±1.14## 2.70±0.78##西藥組 9.20±0.98##△△10.30±1.35##△5.70±0.90##△1.90±0.70#△中藥組 9.60±1.20##△△10.60±1.28#△△5.50±0.92#△ 1.80±0.60#△

注：與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01

4 討論

環(huán)境相關(guān)恐懼模型因刺激信號非明確及刺激不可預(yù)知被認為可以較好地模擬彌散而持續(xù)的焦慮狀態(tài)，適合作為GAD的實驗動物模型[2]。該模型制備過程中動物的僵滯時間可反映實驗動物條件性恐懼記憶的消退程度[3]。高架十字迷宮試驗是經(jīng)典的可以有效測量實驗動物焦慮水平的行為學(xué)測試方法[4]。通過對環(huán)境相關(guān)恐懼模型的制備發(fā)現(xiàn)，每個刺激流程大鼠均表現(xiàn)出恐懼記憶的消退，應(yīng)激后的大鼠易激惹、運動活力降低，高架十字迷宮測試中開臂活動次數(shù)及時間相對減少，提示該模型大鼠焦慮狀態(tài)明顯。

中醫(yī)學(xué)沒有GAD的病名,依據(jù)GAD的病因及臨床表現(xiàn)，將其歸屬于情志疾病范疇[5]。依照具體的臨床表現(xiàn)，中醫(yī)辨證認為，該病病位主要在肝、心、脾、腎[6]，病理因素見火、痰、濕、瘀[7]多種，所涉證型有肝郁化火、心腎不交、肝郁脾虛、心脾兩虛等，其中肝郁化火證型尤為常見[8]。根據(jù)五行“木克土”及“見肝之病，知肝傳脾”理論，GAD屬肝郁者往往伴有或引發(fā)脾虛，臨床所見GAD患者往往伴神疲、乏力、倦怠、納減等脾虛表現(xiàn)，疏肝清熱健脾法因而被選作本研究的治法。丹梔逍遙散以逍遙散加牡丹皮和梔子而成方，功可疏肝健脾、清熱解郁[9]。

從模型制備過程中對僵滯時間的觀察可見，各組在每個流程不同應(yīng)激階段的僵滯時間所占百分比組內(nèi)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示大鼠在本模型制備過程中未表現(xiàn)出對恐懼記憶的長期記憶效果，考慮與每個流程條件性訓(xùn)練后的恐懼消退有關(guān)。組間比較顯示，中藥疏肝清熱健脾法與丁螺環(huán)酮均可降低大鼠處于應(yīng)激環(huán)境中的僵滯時間，提示兩者對恐懼記憶的消退均有鞏固作用，但疏肝清熱健脾法比丁螺環(huán)酮起效慢。行為學(xué)測評結(jié)果顯示疏肝清熱健脾法與丁螺環(huán)酮均可提高該模型大鼠的運動活力，有效降低焦慮水平，并且從行為學(xué)各項指標來看，兩者干預(yù)效果比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。但治療組高架十字迷宮測試中直立次數(shù)的增多均較對照組更明顯，且治療組體重情況優(yōu)于對照組，因此認為疏肝清熱健脾法具有與丁螺環(huán)酮同等的抗焦慮效果，且在大鼠綜合體質(zhì)及精神狀態(tài)改善方面優(yōu)于丁螺環(huán)酮。李寧等[10]以不確定性空瓶刺激建立GAD模型,并以丹梔逍遙散進行干預(yù)，結(jié)果顯示丹梔逍遙散抗焦慮效果優(yōu)于丁螺環(huán)酮，與本研究結(jié)果有異，考慮可能與模型應(yīng)激方式不同有關(guān)，另也應(yīng)與丁螺環(huán)酮的給藥天數(shù)不同而致起效不同[11]有關(guān)。

概言之，通過環(huán)境相關(guān)恐懼應(yīng)激的方法建立模型，可以造成大鼠明顯的焦慮狀態(tài)，雖然條件性訓(xùn)練階段電擊對實驗動物有軀體刺激，但在環(huán)境相關(guān)恐懼刺激階段及改變的環(huán)境信息階段均避免軀體應(yīng)激成分，而且環(huán)境信息的不確定性有利于引發(fā)動物情緒泛化，易于產(chǎn)生彌散而持續(xù)的焦慮,因而較好地模擬GAD的發(fā)病狀態(tài)。疏肝清熱健脾法與丁螺環(huán)酮在行為學(xué)上均表現(xiàn)出肯定的抗焦慮效果,前者在動物整體體質(zhì)狀態(tài)改善方面效果更優(yōu)。但該模型作為GAD實驗動物模型具體的神經(jīng)病理改變?nèi)杂写剿鳎兴幍淖饔脵C制亦有待更深入的研究。

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