高平蕊， 馬興友， 文 迪， 楊勝昌， 于 峰， 倪志宇， 李淑瑾, 馬春玲， 叢 斌

(河北醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院法醫(yī)學系， 河北省法醫(yī)學重點實驗室，河北 石家莊 050017)

八肽膽囊收縮素(cholecystokinin octapeptide，CCK-8)是迄今體內(nèi)最強的抗阿片肽類物質(zhì)[1]。有研究證明，CCK 受體與內(nèi)源性阿片肽受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分布密切相關(guān)，參與調(diào)節(jié)疼痛、焦慮等情緒和記憶過程[2]，且在阿片成癮過程中也發(fā)揮著重要作用。阿片成癮是一種長時程的生物學效應(yīng)，轉(zhuǎn)錄因子cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein, CREB)在此過程中具有重要的作用，并且磷酸化CREB(pCREB)對下游靶基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控作用可能是嗎啡依賴長時程適應(yīng)性改變的基礎(chǔ)之一。本研究通過觀察CCK-8及CCK受體拮抗劑對嗎啡成癮大鼠額葉皮質(zhì)和海馬CREB及pCREB的影響，探討CCK-8 在嗎啡成癮及戒斷過程中的分子機制，為CCK-8 在戒毒方面的應(yīng)用提供相關(guān)實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動物與試劑

成年雄性 Wistar 大鼠 30 只，體質(zhì)量(200±10) g，由河北省實驗動物中心提供(實驗動物質(zhì)量合格證為901014)。鹽酸嗎啡(沈陽第一制藥廠)；鹽酸納絡(luò)酮和CCK-8(Sigma)；L-364718和LY-288513(Tocris)；CREB、pCREB和β-actin兔抗大鼠單克隆抗體(Cell Signaling)；辣根過氧化物酶-山羊抗兔IgG(KPL)；化學發(fā)光法顯色試劑盒(Santa Cruz)；鏈霉卵白素免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

2 動物模型的建立及分組

參照文獻[3]建立大鼠慢性嗎啡依賴及急性催促戒斷模型：以劑量遞增法連續(xù)皮下注射嗎啡(10、20、30、40、50 mg·kg-1)5 d，每天2次，間隔12 h(8:00、20:00)。第6天 8:00 皮下注射嗎啡 50 mg·kg-1，2 h 后腹腔注射鹽酸納絡(luò)酮(5 mg·kg-1)進行催促戒斷，用改良 Gellert-Holtzman 法[4]評價模型建立是否成功，剔除未成模動物。大鼠隨機分組如下：(1)鹽水對照組(saline-saline, Sal-Sal)：背部皮下注射同等劑量的生理鹽水，12只；(2)嗎啡依賴組(saline-morphine, Sal-Mor)：按照上述方案進行嗎啡皮下注射，12只；(3)戒斷組(morphine-naloxone, Mor-Nal): 按照上述方案給予嗎啡皮下注射后 2 h進行納絡(luò)酮催促戒斷，12只；(4)慢性藥物干預(yù)組(CCK-8/L-364718/LY-288513-Mor-Nal)：給予嗎啡前30 min分別腹腔注射 CCK-8(50 μg·kg-1,n=10)、L-364718(1 mg·kg-1,n=8)、LY-288513(1 mg·kg-1,n=10)，余同(3)；(5)溶劑對照組(vehicle-Mor-Nal)：給予嗎啡前 30 min，注射同等體積的溶劑(DMSO : 1,3-丙二醇=1∶4，1 mL·kg-1)，余同(3)，8只。

3 主要方法

3.1Western blotting 實驗結(jié)束后應(yīng)用腦立體定位模具，參照大鼠腦立體定位圖譜，急性分離大鼠腦額葉皮質(zhì)和海馬。腦組織按每100 mg組織加入1 mL的組織蛋白裂解液( 50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L EDTA，1% NP40，1 mmol/L DTT，1 mmol/L PMSF，1 mg/L aprotinin，1 mg/L pepstatin A，1 mg/L leupeptin) ，用電動勻漿器勻漿30 s，冰浴裂解30 min。4 ℃、12 000 r/min離心20 min 后取上清，用Tiangen公司考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒(微板法)測定蛋白濃度，分裝后-70 ℃凍存?zhèn)溆谩２捎肧DS-PAGE分離蛋白，用水浴式電轉(zhuǎn)移裝置將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5% 脫脂奶粉封閉1 h，Ⅰ抗4℃孵育過夜(1∶1 000稀釋)，TTBS洗膜后，加入HRP標記的羊抗兔IgG Ⅱ抗(1∶10 000稀釋)，37 ℃孵育1 h，化學發(fā)光法顯色1 min，暗盒中曝光1 min，顯影后將X光片用數(shù)碼相機照相后，用ImageJ圖像分析系統(tǒng)對圖像進行吸光度掃描，以各組目的蛋白條帶吸光度值與內(nèi)參照蛋白吸光度值計算相對比值，以對照組的比值作為1，其余各組與之相比，再次計算比值作為統(tǒng)計值。

3.2免疫組織化學 實驗結(jié)束后，用10%水合氯醛麻醉，以0.9%生理鹽水行心腔灌注沖洗后，用4%多聚甲醛固定液灌注固定，迅速斷頭開顱取出全腦，常規(guī)制備組織切片、三步法免疫組織化學染色(Ⅰ抗CREB 1∶400、pCREB 1∶50 稀釋)。采用Media Cybernetics公司IPP圖像分析軟件測定陽性神經(jīng)元平均吸光度值，對CREB和pCREB蛋白表達水平進行半定量分析。

4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(ANOVA)，用最小顯著差異(LSD)法進行兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 嗎啡戒斷模型的建立

實驗中觀察到齒顫、濕狗樣抖動、腹瀉、流淚、流涎、跳躍、體重明顯下降等戒斷癥狀，戒斷組Gellert-Holtzman評分與依賴組相比明顯升高，見圖1。

Figure 1. Effects of CCK-8, L-364718 and LY-288513 on the Gellert-Holtzman score of the overall withdrawal seve-rity.Mean±SD. ▲▲P<0.01 vs Mor-Sal group; *P<0.05,**P<0.01 vs Mor-Nal group; #P<0.05 vs L-364718-Mor-Nal group.

2 CCK-8及其受體拮抗劑對嗎啡戒斷大鼠額葉皮質(zhì)及海馬CREB和pCREB蛋白表達的影響

Western blotting結(jié)果顯示，額葉皮質(zhì)和海馬CREB蛋白在慢性嗎啡作用以及戒斷后均無明顯變化(P>0.05),見圖2A、C；但是pCREB蛋白表達在嗎啡依賴后明顯增加(P<0.01),在納洛酮急性催促戒斷后進一步升高(P<0.01),見圖2B、D。與戒斷組(Mor-Nal)相比，CCK-8、L-364718和LY-288513慢性干預(yù)對大鼠額葉皮質(zhì)CREB蛋白表達無明顯影響，pCREB蛋白表達明顯降低,見圖2A、B；海馬CREB與pCREB蛋白在L-364718和LY-288513慢性干預(yù)后均明顯降低，但CCK-8慢性干預(yù)對CREB蛋白表達無明顯影響，僅pCREB蛋白表達明顯降低,見圖2C、D。

Figure 2. Effects of CCK-8 and CCK receptor antagonist chronic treatments on the expression of CREB (A,C) and pCREB (B,D) in frontal cortex (A,B) and hippocampus (C,D) of morphine withdrawal rats detected by Western blotting.Mean±SD.n=6 in Sal-Sal, Mor-Sal and Mor-Nal groups; n=5 in CCK-8-Mor-Nal and LY-288513-Mor-Nal groups; n=4 in L-364718-Mor-Nal and Vehicle-Mor-Nal groups. ▲▲P<0.01 vs Sal-Sal group; ■■P<0.01 vs Mor-Sal group; **P<0.01 vs Mor-Nal group.

我們選取了額葉皮質(zhì)第二運動(M2)區(qū)和海馬CA1區(qū)錐體細胞層神經(jīng)元作為觀察對象，發(fā)現(xiàn)正常大鼠額葉皮質(zhì)M2區(qū)神經(jīng)元胞漿、胞核均表達CREB蛋白，并且慢性嗎啡作用后無明顯變化(P>0.05)急性納洛酮催促戒斷后CREB蛋白以胞核表達為主，但其表達量無明顯變化(P>0.05),見圖3；pCREB蛋白則僅在胞核中高表達，慢性嗎啡作用后其表達量增加(P<0.01)，急性納洛酮催促戒斷后進一步升高(P<0.01),見圖4。海馬CA1區(qū)錐體細胞層神經(jīng)元中，CREB蛋白在胞漿中高表達，胞核低表達,見圖5；pCREB蛋白則在胞核中高表達,見圖6。CCK-8、L-364718和LY-288513慢性干預(yù)對戒斷大鼠額葉皮質(zhì)M2區(qū)和海馬CA1區(qū)錐體細胞層神經(jīng)元CREB與pCREB蛋白表達的影響與Western blotting的結(jié)果一致。

Figure 3. Effects of CCK-8 and CCK receptor antagonist chronic treatments on the expression of CREB in frontal cortex of morphine withdrawal rats detected by immunohistochemistry.Bar=50 μm. Mean±SD.n=6 in Sal-Sal, Mor-Sal and Mor-Nal groups; n=5 in CCK-8-Mor-Nal and LY-288513-Mor-Nal groups; n=4 in L-364718-Mor-Nal and Vehicle-Mor-Nal groups.

討 論

20世紀80年代，有學者提出腦內(nèi)可能存在阿片肽的對立面，即抗阿片肽，以維持慢性阿片作用下機體的穩(wěn)態(tài)。膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)是一個具有廣泛生物學活性的腦腸肽，它既是胃腸道主要調(diào)節(jié)激素之一，也作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)而發(fā)揮廣泛的生物學作用。CCK-8是迄今體內(nèi)最強的抗阿片肽類物質(zhì)，其通過與靶細胞表面的CCK受體結(jié)合后發(fā)揮多種生物學作用。實驗研究表明，CCK受體拮抗劑不但能針對戒斷癥狀進行對癥治療，而且有一定程度的防止復(fù)吸作用。Blandine等[3]報道CCK2受體的缺失可以導(dǎo)致內(nèi)源性阿片肽的釋放發(fā)生變化。也有研究發(fā)現(xiàn)CCK2受體拮抗劑可以有效地減輕慢性嗎啡作用后納絡(luò)酮催促戒斷癥狀的發(fā)生[4]，明顯抑制嗎啡誘導(dǎo)的條件性位置偏愛的形成[5]。然而關(guān)于CCK-8減輕嗎啡戒斷癥狀的機制尚不完全明確。

Figure 4. Effects of CCK-8 and CCK receptor antagonist chronic treatments on the expression of pCREB in frontal cortex of morphine withdrawal rats detected by immunohistochemistry.Bar=50 μm.Mean±SD.n=6 in Sal-Sal, Mor-Sal and Mor-Nal groups; n=5 in CCK-8-Mor-Nal and LY-288513-Mor-Nal groups; n=4 in L-364718-Mor-Nal and Vehicle-Mor-Nal groups. ▲▲P<0.01 vs Sal-Sal group; ■■P<0.01 vs Mor-Sal group; **P<0.01 vs Mor-Nal group.

阿片類物質(zhì)依賴的神經(jīng)分子生物學機制尚未闡明，其過程涉及到受體、受體后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯和調(diào)控，效應(yīng)子的表達及生物效應(yīng)的產(chǎn)生等多個方面。已知急性嗎啡可以降低細胞內(nèi)cAMP水平。然而，隨著嗎啡持續(xù)處理，cAMP水平逐漸恢復(fù)到正常。再用阿片受體拮抗劑處理，cAMP水平就增加到遠遠超過正常值。cAMP的上調(diào)可促進PKA活性的增加，進而促進CREB的轉(zhuǎn)錄因子特異性絲氨酸殘端磷酸化。CREB屬于堿性氨基酸亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族，它具有轉(zhuǎn)錄活性的二聚體和無轉(zhuǎn)錄活性的單體。Ser133是CREB激活的關(guān)鍵位點，磷酸化后的CREB 形成同源二聚體或與CREB/ATF 家族的其它成員形成異二聚體，使CREB活化[6]。目前普遍認為，磷酸化激活的CREB形成二聚體與cAMP反應(yīng)元件(cAMP response element, CRE)結(jié)合，引起一組靶基因表達上調(diào)，導(dǎo)致多種蛋白產(chǎn)物持續(xù)增多，參與了應(yīng)激、認知等功能的調(diào)節(jié)[7-8]。另外，CREB誘導(dǎo)的蛋白表達還可引起神經(jīng)元可塑性和適應(yīng)性改變，這種適應(yīng)性的改變是慢性嗎啡依賴和耐受的共同環(huán)節(jié)，也是形成慢性嗎啡依賴和戒斷的重要機制之一[9-10]。CREB第133位絲氨酸磷酸化是其調(diào)控基因表達的基本條件，CREB 磷酸化的水平與細胞膜的去極化能力有關(guān), 介導(dǎo)細胞膜的去極化過程, 誘導(dǎo)c-fos基因的表達。磷酸化CREB對下游靶基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控作用可能是嗎啡依賴長時程適應(yīng)性改變的基礎(chǔ)之一，CREB在藥物依賴的形成及表達過程中起著承上啟下的作用。

嗎啡成癮的形成是由多個腦區(qū)共同參與的結(jié)果。額葉皮質(zhì)參與了中腦-皮層多巴胺能系統(tǒng)，涉及高級認知功能與動機功能。海馬作為邊緣結(jié)構(gòu)則廣泛地參與了學習與記憶過程，尤其是長期記憶過程的形成，并且在嗎啡成癮記憶形成過程中起重要作用。慢性阿片處理能減弱海馬CA1區(qū)突觸的長時程增強，改變海馬的突觸可塑性[11]。研究表明額葉皮質(zhì)、海馬等腦區(qū)不僅在成癮記憶方面發(fā)揮著重要作用，同時也參與軀體戒斷癥狀的形成[12-13]。

Figure 5. Effects of CCK-8 and CCK receptor antagonist chronic treatments on the expression of CREB in hippocampus of morphine withdrawal rats detected by immunohistochemistry.Bar=50 μm.Mean±SD.n=6 in Sal-Sal, Mor-Sal and Mor-Nal groups; n=5 in CCK-8-Mor-Nal and LY-288513-Mor-Nal groups; n=4 in L-364718-Mor-Nal and Vehicle-Mor-Nal groups.**P<0.01 vs Mor-Nal group.

在Western blotting實驗結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)慢性嗎啡作用后，大鼠額葉皮質(zhì)和海馬CREB蛋白表達無明顯變化，但pCREB蛋白表達明顯增加。納洛酮急性催促戒斷后，CREB蛋白表達仍未發(fā)生明顯變化，pCREB蛋白表達進一步升高。與戒斷組相比，CCK-8、L-364718和LY-288513慢性干預(yù)對大鼠額葉皮質(zhì)CREB蛋白表達無明顯影響，pCREB蛋白表達明顯降低；L-364718和LY-288513急性干預(yù)對大鼠額葉皮質(zhì)CREB/pCREB蛋白表達均無明顯影響。海馬CREB和pCREB蛋白表達在L-364718和LY-288513慢性干預(yù)后均明顯降低，但CCK-8慢性干預(yù)及L-364718、LY-288513急性干預(yù)對CREB蛋白表達無明顯影響，僅pCREB蛋白表達明顯降低。CCK-8急性干預(yù)對戒斷大鼠額葉皮質(zhì)、海馬CREB與pCREB蛋白表達均無明顯影響。免疫組織化學結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常大鼠額葉皮質(zhì)M2區(qū)神經(jīng)元胞漿、胞核均表達CREB蛋白，并且慢性嗎啡作用后無明顯變化；急性納洛酮催促戒斷后CREB蛋白以胞核表達為主，但其表達量無明顯變化。pCREB蛋白則在胞核中高表達，慢性嗎啡作用后其表達量增加，急性納洛酮催促戒斷后進一步升高。海馬CA1區(qū)錐體細胞層神經(jīng)元中，CREB蛋白在胞漿中高表達，而胞核低表達；pCREB蛋白則在胞核中高表達。CCK-8、L-364718和LY-288513慢性干預(yù)對戒斷大鼠額葉皮質(zhì)M2區(qū)和海馬CA1區(qū)錐體細胞層神經(jīng)元CREB與pCREB蛋白表達的影響與Western blotting實驗中的結(jié)果一致。

分析所得到的實驗結(jié)果，我們考慮給予CCK受體拮抗劑后，拮抗了內(nèi)源性CCK的作用，使CCK的生理效應(yīng)喪失，減輕了嗎啡戒斷癥狀，并使受體后途徑的相關(guān)指標發(fā)生了相應(yīng)變化。CCK受體包括CCK1和CCK2受體，分別與Gq和Gq/Gs偶聯(lián)。CCK1受體通過IP3-Ca2+-CaMK-CREB以及DAG-PKC-CREB信號通路，CCK2受體通過cAMP-PKA-CREB以及DAG-PKC-CREB信號通路調(diào)節(jié)下游基因表達，參與體內(nèi)多種生理功能的調(diào)節(jié)。這提示CCK1和CCK2受體拮抗劑均可通過各自的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路降低嗎啡戒斷大鼠額葉皮質(zhì)和海馬內(nèi)CREB磷酸化的水平，進而減輕嗎啡戒斷癥狀。而CCK-8慢性干預(yù)卻減輕了納洛酮引起的急性催促戒斷癥狀，與CCK受體拮抗劑的作用一致。本文認為，這與CCK-8的效應(yīng)濃度有密切關(guān)系[14-16]，并推測在注射嗎啡前外源性給予高濃度CCK-8慢性干預(yù)時，發(fā)揮的是藥理效應(yīng)，其可能通過抑制外源性阿片物質(zhì)和阿片受體的結(jié)合，或者影響外源性阿片物質(zhì)所產(chǎn)生的后效應(yīng)而發(fā)揮作用；另一方面，高濃度的CCK還有可能通過直接激活阿片受體發(fā)揮作用[17]，其具體機制還需進一步探討。

Figure 6. Effects of CCK-8 and CCK receptor antagonist chronic treatments on the expression of pCREB in hippocampus of morphine withdrawal rats detected by immunohistochemistry. Bar=50 μm. Mean±SD.n=6 in Sal-Sal, Mor-Sal and Mor-Nal groups; n=5 in CCK-8-Mor-Nal and LY-288513-Mor-Nal groups; n=4 in L-364718-Mor-Nal and Vehicle-Mor-Nal groups..▲▲P<0.01 vs Sal-Sal group; ■■P<0.01 vs Mor-Sal group; **P<0.01 vs Mor-Nal group.

總之，CCK在嗎啡成癮及戒斷過程中發(fā)揮了重要作用，并通過調(diào)節(jié)受體后相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控信號蛋白CREB的表達及其磷酸化過程而發(fā)揮此作用，為戒毒提供了一種新的思路。

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