夏忠勝， 鐘 娃， 于 濤， 練國達(dá)， 周慧敏， 陳廣成

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州 510120)

結(jié)腸癌是西方國家最常見的胃腸道惡性腫瘤，是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的第二常見原因。在過去的20年，結(jié)腸癌的發(fā)病率在中國一直不斷增長。結(jié)腸癌、肺癌及乳腺癌成為近20年中國增長最快的3種惡性腫瘤。因此，結(jié)腸癌已成為越來越嚴(yán)重的社會(huì)健康問題。大多數(shù)結(jié)腸癌患者診斷時(shí)已是中晚期，因此，單純靠外科手術(shù)不能完全治愈這些患者，必須同時(shí)輔以化療或放療等治療方法。因此，化療在中晚期結(jié)腸癌患者治療中仍具有非常重要的作用。但迄今為止，大多數(shù)結(jié)腸癌患者對(duì)化療藥物反應(yīng)有限，即使是最佳的聯(lián)合化療方案，也只有不到50%的結(jié)腸癌患者有效。而且，在這些不到50%有效的結(jié)腸癌患者中，化療緩解后停藥一段時(shí)間又會(huì)復(fù)發(fā)[1]。導(dǎo)致這些現(xiàn)象的根本原因就在于結(jié)腸癌細(xì)胞獲得了多藥耐藥性(multidrug resistance, MDR)。

導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥的傳統(tǒng)經(jīng)典機(jī)制包括腫瘤細(xì)胞表達(dá)P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated protein, MRP)或肺癌耐藥蛋白(lung cancer resistance protein, LRP)等膜蛋白[2]，這些跨膜蛋白能將化療藥物泵出細(xì)胞外，從而使腫瘤細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度降低，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生抵抗。針對(duì)這些蛋白的MDR逆轉(zhuǎn)劑，包括鈣拮抗劑、反義核酸、小干擾RNA[3]等，在體外實(shí)驗(yàn)中雖然能逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性，但在體內(nèi)特別是在人體，與化療藥聯(lián)用并不能改善腫瘤患者的預(yù)后。

近年來腫瘤干細(xì)胞概念的出現(xiàn)為解釋上述現(xiàn)象提供了一種新的思路。目前認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞在腫瘤產(chǎn)生多藥耐藥性過程中起到非常重要的作用。為了靶向殺滅腫瘤干細(xì)胞，人們一直在努力尋找腫瘤干細(xì)胞的特異標(biāo)記。CD133、CD44 等曾被認(rèn)為是包括結(jié)腸癌在內(nèi)的腫瘤干細(xì)胞的特異標(biāo)志[4]，但有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在某些腫瘤中，CD133陰性的腫瘤細(xì)胞亦具有腫瘤干細(xì)胞特性[5]，因此CD133是否能作為腫瘤干細(xì)胞的特異標(biāo)志物及腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的靶點(diǎn)仍存有爭議。

腫瘤細(xì)胞中的側(cè)群(side population，SP)細(xì)胞現(xiàn)已被公認(rèn)為具有腫瘤干細(xì)胞樣特性，其具有自我更新及分化的特點(diǎn)，并對(duì)多種化療藥物耐藥[6]。SP細(xì)胞通常會(huì)表達(dá)MDR1、BCRP1或ABCG2等膜蛋白。但同時(shí)也有研究指出, 在多種非SP 細(xì)胞中也有一定程度的BCRP1表達(dá), 提示這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)SP 細(xì)胞的表型有作用, 但并不是特異的標(biāo)志物[7]。Behbod等[8]曾探討過乳腺癌SP細(xì)胞的基因標(biāo)志，但目前尚未見有關(guān)探討結(jié)腸癌SP細(xì)胞與非SP細(xì)胞在microRNA表達(dá)譜方面差異的報(bào)道。本文通過比較幾種結(jié)腸癌細(xì)胞系中SP細(xì)胞與非SP細(xì)胞microRNA表達(dá)譜的差異，探討結(jié)腸癌SP細(xì)胞的microRNA標(biāo)志物，為結(jié)腸癌SP細(xì)胞的靶向治療尋找新的特異靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

RPMI-1640培養(yǎng)液、Hoechst 33342、MTT和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)均購自Sigma-Aldrich；胎牛血清及RNA提取試劑TRIzol購自Invitrogen；5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司；草酸鉑(oxaliplatin)購自Sanofi-Synthelabo；阿霉素(adriamycin)購自Pharmacia & Upjohn；miRNeasy Mini Kit 購自Qiagen；microRNA芯片采用Exiqon的miRCURY LNATMmicroRNA Array (v.18.0)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒由上?？党缮锛夹g(shù)公司提供；PCR擴(kuò)增儀采用Applied Biosystems的GeneAmp? PCR System 9700；流式細(xì)胞儀為BD Biosciences產(chǎn)品。

2 細(xì)胞培養(yǎng)

結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-15、HT-29及LoVo均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。3種細(xì)胞株均采用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液在5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

3 主要方法

3.1SP細(xì)胞的分選 參照文獻(xiàn)[9]的方法，并進(jìn)行部分改良。培養(yǎng)的細(xì)胞用胰酶消化處理后再用PBS洗滌，然后用含5%的胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液于37 ℃重新混懸細(xì)胞。預(yù)孵育10 min后，采用5 mg/L Hoechst 33342染料標(biāo)記細(xì)胞90 min(加或不加維拉帕米；維拉帕米是ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制劑，工作濃度為50 μmol/L)。采用1 mg/L碘化丙啶標(biāo)記死亡細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比染色。接下來，每組細(xì)胞采用BD FACSAia II熒光激活細(xì)胞分選系統(tǒng)對(duì)1×106活細(xì)胞進(jìn)行分析及分選。Hoechst 33342染料的激發(fā)波長為355 nm，其熒光強(qiáng)度采用雙波長濾光鏡(分別為450 nm的Hoechst藍(lán)和635 nm的Hoechst紅)檢測。通過630/BP30濾光鏡測量碘化丙啶標(biāo)記從而將死亡細(xì)胞區(qū)分開來。

3.2IC50測定 細(xì)胞活力的測定采用MTT法，細(xì)胞接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為1×104，生長24 h 后加入抗腫瘤藥。用倍比稀釋濃度的5-氟尿嘧啶(2～256 mg/L)、草酸鉑(0.5～64 mg/L)及阿霉素(1～128 mg/L)分別處理結(jié)腸癌HCT-15、HT-29及LoVo細(xì)胞。細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育72 h后每孔加30 μL 5 g/L MTT，37 ℃孵育4 h，棄培養(yǎng)液，加150 μL DMSO，室溫振蕩5 min，在Synergy HT酶聯(lián)儀上以570 nm波長讀取吸光度(A)。未經(jīng)任何處理的對(duì)照組細(xì)胞活力設(shè)為100%，通過與對(duì)照組比較計(jì)算其它各組細(xì)胞活力。根據(jù)各細(xì)胞系不同濃度抗腫瘤藥處理3 d 時(shí)的A值，計(jì)算各細(xì)胞系各抗腫瘤藥3 d 的IC50。

3.3MicroRNA芯片分析 MicroRNA芯片分析由上?？党缮锛夹g(shù)公司完成。(1)RNA的提取：總RNA的分離采用Invitrogen的TRIzol試劑和Qiagen的miRNeasy Mini Kit試劑盒，具體方法參照廠家的說明書進(jìn)行，其中miRNeasy Mini Kit試劑盒能有效地恢復(fù)所有種類的RNA，包括miRNAs。RNA的定性及定量檢測采用Nanodrop Technologies的ND-1000光譜儀。采用凝膠電泳檢測RNA的完整性。(2)RNA標(biāo)記和雜交：從樣本分離得到RNA后，采用Exiqon的miRCURY LNATMmicroRNA Hy3/Hy5 Power Labeling Kit標(biāo)記試劑盒進(jìn)行miRNA的標(biāo)記。RNeasy Mini Kit(Qiagen)濃縮標(biāo)記樣品, 然后應(yīng)用miRCURY LNATMmicroRNA Array (v.18.0) (Exiqon)和Hybridization System (Nimblegen Systems Inc.)進(jìn)行芯片雜交。 具體步驟按各試劑說明書進(jìn)行。(3)數(shù)據(jù)分析：雜交后芯片用Axon GenePix 4000B Microarray Scanner (Axon)進(jìn)行圖像掃描, 所得數(shù)據(jù)使用GenePix Pro 6.0軟件(Axon)分析。每個(gè)樣本重復(fù)檢測4次，各樣本microRNA芯片分析的重復(fù)性檢測采用相關(guān)性分析，計(jì)算相關(guān)系數(shù)R。通過原始值減去背景值來做修正, 并用中值做標(biāo)準(zhǔn)化，分別計(jì)算出每組2個(gè)樣本中miRNA的標(biāo)準(zhǔn)值及比值，以比值差異大于或等于2為差異有顯著性。

3.4MicroRNA表達(dá)的RT-PCR驗(yàn)證 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測目的miRNA表達(dá)量：根據(jù)microRNA芯片分析結(jié)果，挑選出在3種細(xì)胞系的SP細(xì)胞中表達(dá)均上調(diào)2倍以上的microRNA,包括miR-5000-3p、miR-5009-3p和miR-552，對(duì)這3種microRNA的表達(dá)上調(diào)進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證。取0.8 μg總RNA, 應(yīng)用miRNA Isolation Kit (Ambion)分離小于100 nt的小分子RNA, 然后應(yīng)用MMLV reverse transcriptase (Epicentre)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,逆轉(zhuǎn)錄引物分別為：5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAAT-TGCACTGGATACGACTCCAAG-3’(miR-5000-3p)，5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCA-ATTGCACTGGATACGACTTTTGG-3’(miR-5009-3p)，5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAAT-TGCACTGGATACGACTTGTCTA-3’(miR-552)，5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’(U6)，U6為內(nèi)參照。再進(jìn)行定量PCR檢測，PCR擴(kuò)增引物序列見表1。PCR條件：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán)。采用U6 RNA作為內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行歸一化。樣品目的基因的相對(duì)表達(dá)率(relative expression, RE)采用ΔΔCt方法計(jì)算，RE = 2ΔΔCt(Ct表示反應(yīng)熒光強(qiáng)度顯著大于背景值時(shí)的循環(huán)數(shù)，ΔCtsample=Ctsample-CtU6 sample，ΔCtcontrol=Ctcontrol-CtU6 control，ΔΔCt =ΔCtsample-ΔCtcontrol)。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR使用引物列表

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，2組之間均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 SP細(xì)胞的分選

采用Hoechst 33342標(biāo)記結(jié)腸癌細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)分選結(jié)腸癌SP細(xì)胞。圖1顯示，不同結(jié)腸癌細(xì)胞系都有一定比例的SP細(xì)胞，只是比例不同。HCT-15、HT-29及LoVo細(xì)胞中SP細(xì)胞的比例分別為16.75%、13.02%及9.52%;采用50 μmol/L維拉帕米處理后，HCT-15、HT-29及LoVo細(xì)胞中SP細(xì)胞的比例分別降至1.76%、0.58%及0.11%。

2 各抗腫瘤藥對(duì)結(jié)腸癌SP細(xì)胞和非SP細(xì)胞的IC50

HCT-15、HT-29及LoVo細(xì)胞分選后的SP細(xì)胞及非SP細(xì)胞分別采用不同濃度的5-氟尿嘧啶、草酸鉑及阿霉素處理3 d，然后測定各細(xì)胞的細(xì)胞活力。不同濃度的5-氟尿嘧啶處理HCT-15結(jié)腸癌細(xì)胞3 d 后，在同一濃度的5-氟尿嘧啶作用下，HCT-15結(jié)腸癌細(xì)胞中SP細(xì)胞的細(xì)胞活力均高于非SP細(xì)胞。從表2可見，5-氟尿嘧啶對(duì)HCT-15細(xì)胞中SP細(xì)胞的IC50較非SP細(xì)胞提高了近5倍。不同濃度的草酸鉑處理HCT-15結(jié)腸癌細(xì)胞3 d后，在同一濃度的草酸鉑作用下，HCT-15結(jié)腸癌細(xì)胞中SP細(xì)胞的細(xì)胞活力均高于非SP細(xì)胞，阿雷素對(duì)HCT-15細(xì)胞中SP細(xì)胞的IC50較非SP細(xì)胞提高了近4倍，見表2。不同濃度的阿霉素處理HCT-15細(xì)胞3 d 后，在同一濃度的阿霉素作用下，HCT-15結(jié)腸癌細(xì)胞中SP細(xì)胞的細(xì)胞活力均高于非SP細(xì)胞，阿霉素對(duì)HCT-15細(xì)胞中SP細(xì)胞的IC50較非SP細(xì)胞提高了近6倍，見表2。

Figure 1. Side population analysis of 3 kinds of colon cancer cell lines. A: the ratio of SP cells in HT-29 cell line; B: the ratio of SP cells in LoVo cell line; C: the ratio of SP cells in HCT-15 cell line; D: the ratio of SP cells in HT-29 cell line treated with verapamil; E: the ratio of SP cells in LoVo cell line treated with verapamil; F: the ratio of SP cells in HCT-15 cell line treated with verapamil.

不同濃度的5-氟尿嘧啶處理HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞3 d后，在同一濃度的5-氟尿嘧啶作用下，HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞中SP細(xì)胞的細(xì)胞活力均高于非SP細(xì)胞。從表2可見，5-氟尿嘧啶對(duì)HT-29細(xì)胞中SP細(xì)胞的IC50較非SP細(xì)胞提高了近5倍。不同濃度的草酸鉑處理HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞3 d 后，在同一濃度的草酸鉑作用下，HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞中SP細(xì)胞的細(xì)胞活力均高于非SP細(xì)胞，草酸鉑對(duì)HT-29細(xì)胞中SP細(xì)胞的IC50較非SP細(xì)胞提高了近5倍，見表2。不同濃度的阿霉素處理HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞3 d后，在同一濃度的阿霉素作用下，HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞中SP細(xì)胞的細(xì)胞活力均高于非SP細(xì)胞，阿霉素對(duì)HT-29細(xì)胞中SP細(xì)胞的IC50較非SP細(xì)胞提高了近5倍，見表2。

不同濃度的5-氟尿嘧啶處理LoVo細(xì)胞3 d后，在同一濃度的5-氟尿嘧啶作用下，LoVo結(jié)腸癌細(xì)胞中SP細(xì)胞的細(xì)胞活力均高于非SP細(xì)胞，從表2可見，5-氟尿嘧啶對(duì)LoVo細(xì)胞中SP細(xì)胞的IC50較非SP細(xì)胞提高了近5倍。不同濃度的草酸鉑處理LoVo結(jié)腸癌細(xì)胞3 d 后，在同一濃度的草酸鉑作用下，LoVo細(xì)胞中SP細(xì)胞的細(xì)胞活力均高于非SP細(xì)胞，草酸鉑對(duì)LoVo細(xì)胞中SP細(xì)胞的IC50較非SP細(xì)胞提高了近6倍，見表2。不同濃度的阿霉素處理LoVo細(xì)胞3 d 后，在同一濃度的阿霉素作用下，LoVo細(xì)胞中SP細(xì)胞的細(xì)胞活力均高于非SP細(xì)胞，阿霉素對(duì)LoVo細(xì)胞中SP細(xì)胞的IC50較非SP細(xì)胞提高了近4倍，見表2。

表2 抗腫瘤藥對(duì)3種人結(jié)腸癌細(xì)胞系SP細(xì)胞和非SP細(xì)胞的IC50

3 MicroRNA芯片檢測的重復(fù)性檢驗(yàn)

HCT-15、HT-29及LoVo細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分選出SP細(xì)胞及非SP細(xì)胞，共6個(gè)樣本進(jìn)行 microRNA芯片檢測，每個(gè)樣本重復(fù)檢測4次，計(jì)算各樣本的相關(guān)系數(shù)R(反映樣本檢測的重復(fù)性),結(jié)果見表3。

表3 各樣本microRNA芯片檢測的相關(guān)系數(shù)R值

4 結(jié)腸癌SP細(xì)胞的microRNA表達(dá)譜分析

HCT-15、HT-29及LoVo細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分選出SP細(xì)胞及非SP細(xì)胞，采用miRCURY LNATMmicroRNA Array (v.18.0) 檢測各細(xì)胞系SP細(xì)胞與非SP細(xì)胞microRNAs的表達(dá)譜，并比較每一細(xì)胞系中SP細(xì)胞與非SP細(xì)胞microRNAs的表達(dá)差異，從中篩選出差異達(dá)到2倍以上的microRNAs。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在HCT-15細(xì)胞系，SP細(xì)胞中microRNAs表達(dá)上調(diào)的有106種，包括miR-5000-3p、miR-5009-3p、miR-552、miR-17-5p、miR-3146、miR3619-3p等；表達(dá)下調(diào)的有52種，包括miR-4664-3p、miR-940、miR-133b、miR-4667-3p、miR-484、miR-4312等(見表4，因版面所限，表中僅分別列出10種表達(dá)上調(diào)及10種表達(dá)下調(diào)的microRNAs)。在HT-29細(xì)胞系，SP細(xì)胞中microRNAs表達(dá)上調(diào)的有58種，包括miR-5000-3p、miR-5009-3p、miR-552、 miR-611、miR-365b-5p、miR-3667-3p等；表達(dá)下調(diào)的有63種，包括miR-125b-5p、miR-30b-5p、miR-101-3p、miR-23a-3p、miR-24-3p、let-7g-5p等(見表5，因版面所限，表中僅分別列出10種表達(dá)上調(diào)及10種表達(dá)下調(diào)的microRNAs)。在LoVo細(xì)胞系，SP細(xì)胞中microRNAs表達(dá)上調(diào)的有47種，包括miR-5000-3p、miR-5009-3p、miR-552、miR-3915、miR-4777-5p、miR-301a-3p等；表達(dá)下調(diào)的有22種，包括miR-34a-5p、miR-30e-3p、miR-33b-5p、miR-199a-5p、miR-125b-5p、miR-1275等(見表6，因版面所限，表中僅分別列出10種表達(dá)上調(diào)及10種表達(dá)下調(diào)的microRNAs)。在3種細(xì)胞系中，miR-5000-3p、miR-5009-3p及miR-552在SP細(xì)胞中均表達(dá)上調(diào)，而沒有1種microRNA在3種細(xì)胞系的SP細(xì)胞中表達(dá)均下調(diào)。

5 3種表達(dá)上調(diào)microRNAs的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

microRNA表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，miR-5000-3p、miR-5009-3p及miR-552在3種結(jié)腸癌細(xì)胞系的SP細(xì)胞中均表達(dá)上調(diào)，為確認(rèn)此結(jié)果，我們采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)該結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。以U6為內(nèi)參照，計(jì)算SP細(xì)胞與非SP細(xì)胞各microRNAs的相對(duì)表達(dá)量。將3種microRNAs的實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果與microRNA芯片檢測結(jié)果比對(duì)，在HCT-15細(xì)胞系，microRNA芯片檢測顯示SP細(xì)胞較非SP細(xì)胞miR-5000-3p、miR-5009-3p及miR-552的表達(dá)量分別增加6.76倍、2.37倍和6.96倍，而實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示SP細(xì)胞較非SP細(xì)胞miR-5000-3p、miR-5009-3p及miR-552的表達(dá)量分別增加2.20倍、2.01倍和3.85倍；在HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞系，microRNA芯片檢測顯示SP細(xì)胞較非SP細(xì)胞miR-5000-3p、miR-5009-3p及miR-552的表達(dá)量分別增加2.25倍、2.26倍和2.81倍，而實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示SP細(xì)胞較非SP細(xì)胞在miR-5000-3p、miR-5009-3p及miR-552表達(dá)量分別增加2.35倍、3.46倍和2.63倍；在LoVo細(xì)胞系，microRNA芯片檢測顯示SP細(xì)胞較非SP細(xì)胞miR-5000-3p、miR-5009-3p及miR-552的表達(dá)量分別增加3.28倍、2.35倍和8.13倍，而實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示SP細(xì)胞較非SP細(xì)胞miR-5000-3p、miR-5009-3p及miR-552的表達(dá)量分別增加2.57倍、2.00倍和2.59倍。上述結(jié)果顯示出microRNA芯片檢測結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果具有良好的一致性。

表4 HCT-15人結(jié)腸癌細(xì)胞系SP細(xì)胞與非SP細(xì)胞間microRNA的差異表達(dá)

表5 HT-29人結(jié)腸癌細(xì)胞系SP細(xì)胞與非SP細(xì)胞間microRNA的差異表達(dá)

表6 LoVo人結(jié)腸癌細(xì)胞系SP細(xì)胞與非SP細(xì)胞間microRNA的差異表達(dá)

討 論

在本研究中，我們采用Hoechst 33342熒光染料，利用流式細(xì)胞術(shù)從結(jié)腸癌細(xì)胞系中成功分離出結(jié)腸癌SP細(xì)胞。SP細(xì)胞最先由Goodell等[9]于1996年報(bào)道描述。Haraguchi等[10]從胃腸道腫瘤細(xì)胞系中分離出SP細(xì)胞，盡管他們從肝癌細(xì)胞系Huh7中分離出SP細(xì)胞，并報(bào)道了該SP細(xì)胞的基因表達(dá)譜以及對(duì)化療藥物的耐藥性，但他們尚未報(bào)道SP細(xì)胞的microRNA表達(dá)譜。Schetter等[11]和Callari等[12]報(bào)道了結(jié)腸癌細(xì)胞的microRNA表達(dá)譜，但他們采用的結(jié)腸癌細(xì)胞來源于結(jié)腸癌患者的組織標(biāo)本，他們并未報(bào)道結(jié)腸癌SP細(xì)胞的microRNA表達(dá)譜。在本研究中，我們從3種結(jié)腸癌細(xì)胞系包括HCT-15、HT-29及LoVo細(xì)胞系中成功分離純化出結(jié)腸癌SP細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)分析檢測發(fā)現(xiàn)，HCT-15、HT-29及LoVo細(xì)胞系的SP細(xì)胞比例分別為16.75%、13.02% 及9.52%。Inoda等[13]報(bào)道HCT-15、HT-29及LoVo細(xì)胞系的SP細(xì)胞比例分別為11.1%、10.4%和9.1%。本研究測定的HCT-15、HT-29及LoVo細(xì)胞系的SP細(xì)胞比例與Inoda等[13]報(bào)道的比例相似。這說明每一種結(jié)腸癌細(xì)胞系均含有一定比例的SP細(xì)胞，只是SP細(xì)胞的比例有所不同。

從HCT-15、HT-29及LoVo細(xì)胞系分選出的SP細(xì)胞和非SP細(xì)胞分別采用不同濃度的5-氟尿嘧啶、草酸鉑及阿霉素處理3 d。本研究發(fā)現(xiàn)，不論是HCT-15及HT-29細(xì)胞系，還是LoVo細(xì)胞系，在相同濃度的5-氟尿嘧啶作用下，從這3種結(jié)腸癌細(xì)胞系中分選出的SP細(xì)胞的細(xì)胞活力均明顯高于非SP細(xì)胞的細(xì)胞活力。這表明結(jié)腸癌細(xì)胞系中的SP細(xì)胞比非SP細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶更耐藥。類似的結(jié)果在采用草酸鉑或阿霉素處理時(shí)同樣也可見到。由此可見，結(jié)腸癌細(xì)胞系中的SP細(xì)胞比非SP細(xì)胞對(duì)化療藥更耐藥。Inoda等[13]報(bào)道從結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480、HT-29及HCT-15中分選出的SP細(xì)胞比非SP細(xì)胞對(duì)諸如irinotecan或etoposide等化療藥更耐藥。所有這些均表明結(jié)腸癌細(xì)胞中的SP細(xì)胞比非SP細(xì)胞對(duì)化療藥物更具抵抗性。由此可見，結(jié)腸癌細(xì)胞中的SP細(xì)胞在結(jié)腸癌的多藥耐藥性中起著非常重要的作用。

既然SP細(xì)胞在結(jié)腸癌的多藥耐藥性中起著非常重要的作用，因此本研究想探討結(jié)腸癌SP細(xì)胞的特異的生物標(biāo)志，以便通過靶向調(diào)節(jié)這些生物標(biāo)志的表達(dá)而達(dá)到逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞的多藥耐藥性。在以往的研究中，Behbod等[8]曾探討過乳腺癌SP細(xì)胞的基因標(biāo)志，基因芯片分析提示乳腺癌細(xì)胞中的SP細(xì)胞是一類表達(dá)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期關(guān)鍵基因的乳腺細(xì)胞亞群。本研究采用microRNA芯片對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系中的SP細(xì)胞及非SP細(xì)胞進(jìn)行了microRNA表達(dá)譜的分析，通過比較SP細(xì)胞與非SP細(xì)胞microRNA表達(dá)的差異，旨在探索結(jié)腸癌SP細(xì)胞的microRNA生物標(biāo)志。本研究采用的microRNA檢測芯片為Exiqon的miRCURYTMLNA Array (V.18.0)，該microRNA芯片是目前最新版本的microRNA芯片檢測系統(tǒng)，可同時(shí)檢測2 000多種microRNAs。表3顯示的是各樣本microRNA芯片重復(fù)檢測的相關(guān)系數(shù)R值，同一樣本，R值越大則表示芯片檢測的重復(fù)性越好，從表3可以看出，各樣本重復(fù)檢測的相關(guān)系數(shù)R值均接近1，說明各樣本芯片檢測的重復(fù)性非常好，同時(shí)也說明該芯片檢測結(jié)果的可靠性。

通過對(duì)各樣本進(jìn)行microRNA芯片檢測，我們發(fā)現(xiàn)，在HCT-15、HT-29 及LoVo細(xì)胞系，有3種microRNAs包括miR-5000-3p、miR-5009-3p及miR-552在這3種結(jié)腸癌細(xì)胞系的SP細(xì)胞中均表達(dá)上調(diào)。但沒有發(fā)現(xiàn)一種microRNA在這3種結(jié)腸癌細(xì)胞系的SP細(xì)胞中均表達(dá)下調(diào)。而且這些發(fā)現(xiàn)通過RT-PCR的方法同時(shí)也得到了證實(shí)。在以往的研究中，Schetter等[11]和Callari等[12]曾報(bào)道結(jié)腸癌細(xì)胞的microRNA表達(dá)譜。但他們采用的結(jié)腸癌細(xì)胞樣本來源于結(jié)腸癌患者的結(jié)腸癌組織標(biāo)本。Alexander等[14]報(bào)道了結(jié)腸癌患者的糞便microRNAs表達(dá)譜，但該研究比較的是結(jié)腸癌患者與健康志愿者的糞便標(biāo)本。Hofsli等[15]探討了結(jié)腸癌患者的血清microRNAs表達(dá)譜，但該研究比較的是結(jié)腸癌患者與健康對(duì)照者的血清標(biāo)本。盡管Zhang等[16]和Fang等[17]曾探討過結(jié)腸癌干樣細(xì)胞microRNAs的表達(dá)譜，但他們采用的結(jié)腸癌干樣細(xì)胞是基于CD133或CD133/CD44細(xì)胞標(biāo)記分選獲得的細(xì)胞，而不是SP細(xì)胞。除此之外，該研究僅采用一種結(jié)腸癌細(xì)胞系來比較結(jié)腸癌干樣細(xì)胞與非干樣細(xì)胞microRNAs表達(dá)譜的差異。上述所有的研究均未進(jìn)行對(duì)結(jié)腸癌SP細(xì)胞microRNA表達(dá)譜的探討。因此，本研究是首次報(bào)道結(jié)腸癌SP細(xì)胞microRNA表達(dá)譜的檢測，并比較結(jié)腸癌SP細(xì)胞與非SP細(xì)胞microRNA表達(dá)譜的差異，以探索結(jié)腸癌SP細(xì)胞的microRNA生物標(biāo)志。

本研究通過分析比較3種結(jié)腸癌細(xì)胞系包括HCT-15、HT-29及LoVo的SP細(xì)胞與非SP細(xì)胞microRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)有3種microRNA包括miR-5000-3p、miR-5009-3p 及miR-552在這3種結(jié)腸癌細(xì)胞的SP細(xì)胞中均表達(dá)上調(diào)，而其它的microRNA在結(jié)腸癌SP細(xì)胞中表達(dá)沒有變化，或者只是在其中的1種或2種結(jié)腸癌SP細(xì)胞中有改變，提示miR-5000-3p、miR-5009-3p 及miR-552可能是結(jié)腸癌SP細(xì)胞潛在的microRNA生物標(biāo)志。我們知道，SP細(xì)胞在結(jié)腸癌的多藥耐藥性中具有重要的作用，針對(duì)SP細(xì)胞的靶向治療有可能逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌的多藥耐藥性，因此這3種microRNA有可能成為結(jié)腸癌治療的潛在靶點(diǎn)。在將來的研究中，可以采用針對(duì)這3種microRNA的反義RNA靶向抑制特異microRNA的表達(dá)，以進(jìn)一步探討靶向miR-5000-3p、miR-5009-3p或miR-552的反義RNA能否逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞的多藥耐藥性。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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