孔麗君， 張立霞， 欒希英， 張麗沙， 王緒菡， 于恒運(yùn)， 張?jiān)轮?/p>

(濱州醫(yī)學(xué)院 1山東省腫瘤分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室， 2煙臺(tái)附屬醫(yī)院，山東 煙臺(tái) 264003)

肺癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤譜中的主要腫瘤之一，目前已發(fā)展成為我國(guó)癌癥死亡率的首位[1]，肺癌也是世界上發(fā)病率和致死率最高的腫瘤，與吸煙、大氣污染、慢性肺病及內(nèi)在因素都有密切關(guān)系，根據(jù)其病理特點(diǎn)，肺癌被分為非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(small-cell lung cancer, SCLC)。隨著環(huán)境污染的加重，SCLC的發(fā)病率也在逐年增加，約占肺癌的20%，其惡性程度高，倍增時(shí)間短，轉(zhuǎn)移早，易復(fù)發(fā)，盡管對(duì)化療、放療敏感，但治療水平在近30多年來仍處于平臺(tái)期，5年生存率小于2%，因此探討新的治療方案具有重要意義。

Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族1 (Ras-association domain family 1,RASSF1) 基因根據(jù)轉(zhuǎn)錄后剪切位點(diǎn)的不同有2個(gè)主要的轉(zhuǎn)錄本RASSF1A和RASSF1C，在正常的上皮細(xì)胞中兩者均有表達(dá)。RASSF1基因位于3p21.3，其編碼的蛋白質(zhì)含有2個(gè)結(jié)構(gòu)域，一是羧基末端Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域，另一個(gè)SARAH結(jié)構(gòu)域。Dittfeld等[2]研究顯示RASSF1A的SARAH結(jié)構(gòu)域缺失顯著抑制肺癌細(xì)胞A549的生長(zhǎng)。RASSF1A表達(dá)水平抑制主要由其基因啟動(dòng)子區(qū)域的高度甲基化引起，相關(guān)文獻(xiàn)已在乳腺癌、肺癌、原發(fā)性腎癌、原發(fā)性鼻癌等中有過報(bào)道。本文主要探討RASSFIA抑制小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及其機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞培養(yǎng)和試劑

本研究所用小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H446購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫，培養(yǎng)基為RPMI-1640加10%胎牛血清以及10%青、鏈霉素。新霉素(G418)和碘化丙啶(PI)購(gòu)自Sigma，SYBR Green購(gòu)自大連寶生物科技有限公司，ECL增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自Millipore。細(xì)胞周期素D1(cyclin D1)、cyclin E、細(xì)胞周期素依賴性激酶2 (cyclin-dependent kinase 2, Cdk2)、Cdk4、Cdk6、p15、p16、p18、p19和GAPDH抗體購(gòu)自Santa Cruz，p21、p27和E2F1抗體購(gòu)自Cell Signal Technology。

2 方法

2.1慢病毒載體的構(gòu)建以及包裝 含有人RASSF1A的慢病毒表達(dá)載體pLV.EX3d.P/neo-EF1A>RASSF1A>IRES/eGFP由賽業(yè)廣州生物科技有限公司構(gòu)建，并包裝成慢病毒顆粒，病毒滴度為1×1012TU/L。慢病毒載體經(jīng)測(cè)序證實(shí)序列的正確性。不含RASSF1A基因的陰性對(duì)照病毒由賽業(yè)廣州生物科技有限公司提供。

2.2穩(wěn)定表達(dá)RASSF1A的小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞的構(gòu)建 應(yīng)用24孔板常規(guī)培養(yǎng)H446細(xì)胞，每孔接種5×104個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞密度大約50%左右。24 h后，細(xì)胞貼壁良好，密度70%左右。感染前將慢病毒在冰上緩慢化開，應(yīng)用完全培養(yǎng)基將病毒稀釋10倍，病毒滴度大約在1×1011TU/L左右。應(yīng)用100 μL稀釋后的病毒顆粒取代原先的培養(yǎng)基，12 h后更換完全培養(yǎng)基，96 h后應(yīng)用熒光倒置顯微鏡觀察感染效率。1 g/L G418進(jìn)行篩選，15 d后改用維持濃度0.5 g/L維持培養(yǎng)，30 d后挑取細(xì)胞生長(zhǎng)克隆，繼續(xù)培養(yǎng)，獲取穩(wěn)定表達(dá)RASSF1A的H446細(xì)胞命名為RASSF1A-H446。不含RASSF1A的陰性對(duì)照細(xì)胞命名為GFP-H446。

2.3MTT測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 將1 000個(gè)細(xì)胞常規(guī)鋪96孔板，細(xì)胞生長(zhǎng)24 h后，每孔加入20 μL MTT(5 g/L),繼續(xù)培養(yǎng)4 h,PBS洗3遍。每孔加150 μL二甲基亞砜,低速振蕩10 min,490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度(A)。

2.4流式細(xì)胞術(shù)測(cè)生長(zhǎng)周期 應(yīng)用6孔板常規(guī)培養(yǎng)H446、GFP-H446和RASSF1A-H446細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度為50%左右時(shí)，撤血清使細(xì)胞饑餓24 h。然后加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后,應(yīng)用0.01%EDTA-0.25%胰酶混合液消化細(xì)胞，離心，無菌的PBS洗滌1次。應(yīng)用70%乙醇4 ℃旋轉(zhuǎn)固定過夜，PI染色30 min,PBS洗滌3 次，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。

2.5Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的mRNA表達(dá) 6孔板常規(guī)培養(yǎng)H446、GFP-H446和RASSF1A-H446細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí)，PBS洗3次。每孔加入1 mL Trizol，吹打15 s左右，讓細(xì)胞完全破碎，收集裂解液于1.5 mL EP管中。按照說明書操作進(jìn)行，提取并檢測(cè)RNA濃度。取2 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系如下： RNA 2 μL,5×buffer 4 μL, dNTP 2 μL, 轉(zhuǎn)錄酶1 μL,隨機(jī)引物2 μL,雙蒸水5 μL。程序如下：65 ℃預(yù)變性5 min；37 ℃ 15 min; 98 ℃ 5 min。將以上反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，引物序列見表1。計(jì)算power值，表示不同基因的表達(dá)水平。

表1 引物序列

2.6Western blotting檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá) 6孔板常規(guī)培養(yǎng)H446、GFP-H446和RASSF1A-H446細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí)，PBS洗3次，每孔加入70 μL RAPI裂解液,收集裂解液于1.5 mL EP管中，13 000 r/min、4 ℃離心15 min，分裝上清。BCA法測(cè)蛋白濃度。每孔加入40 μg蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)膜、封閉、I抗4 ℃孵育過夜、II抗常溫孵育40 min、ECL化學(xué)發(fā)光液顯影、壓片、定影。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 穩(wěn)定表達(dá)RASSF1A的H446細(xì)胞的構(gòu)建

將含有RASSF1A基因的慢病毒顆粒感染H446細(xì)胞，96 h后應(yīng)用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的感染效率，發(fā)現(xiàn)慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的效率高達(dá)80%,見圖1A、B。應(yīng)用1 g/L G418對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選，15 d后細(xì)胞出現(xiàn)明顯的單克隆細(xì)胞群，改用0.5 g/L G418進(jìn)行維持培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定表達(dá)RASSF1A的H446細(xì)胞,見圖1C、D。Western blotting結(jié)果表明，LV-RASSF1A組蛋白的表達(dá)顯著高于空白對(duì)照(normal)和陰性對(duì)照(LV-GFP)組,見圖1E。

2 RASSF1A抑制H446細(xì)胞的生長(zhǎng)并阻滯細(xì)胞周期的運(yùn)行

RASSF1A具有抑癌蛋白的特性，在80%～100% SCLC組織和細(xì)胞中表達(dá)缺失。MTT結(jié)果表明，LV-RASSF1A組細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢(圖2A)，而且細(xì)胞周期明顯阻滯在G1期。圖2B顯示,LV-RASSF1A組與空白對(duì)照組及LV-GFP組間均有明顯差異(均P<0.05)。

3 細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)

與正常對(duì)照和陰性對(duì)照相比，在LV-RASSF1A組細(xì)胞中，cyclin D1、cyclin E、Cdk2、Cdk4和Cdk6的表達(dá)沒有明顯變化；p21和p27表達(dá)明顯升高，而p15、p16、p18和p19的表達(dá)沒有明顯變化。由于小細(xì)胞肺癌中抑癌基因Rb缺失，在LV-RASSF1A細(xì)胞中沒有檢測(cè)到Rb蛋白的表達(dá)，但是轉(zhuǎn)錄因子E2F1的表達(dá)明顯降低，見圖3。

討 論

在人類大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中，RASSF1A 的表達(dá)缺失是一個(gè)常見的事件[3]。在本研究中，我們成功構(gòu)建了含有RASSF1A基因的慢病毒表達(dá)載體，并包裝成病毒顆粒。將該病毒顆粒感染小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞，G418篩選后，獲得了穩(wěn)定表達(dá)RASSF1A基因的H446細(xì)胞克隆(命名為：RASSF1A-H446)。MTT和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，而且G1期阻滯較明顯。以上結(jié)果表明RASSF1A能夠明顯抑制細(xì)胞增殖，而且使細(xì)胞周期阻滯在G1期。為探討RASSF1A抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和G1期阻滯的機(jī)制，我們從mRNA和蛋白的水平分析了G1/S期細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，real-time PCR 和Western blotting結(jié)果顯示cyclin D1、cyclin E、Cdk2、Cdk4、Cdk6、p15、p16、p18和p19的表達(dá)沒有明顯變化，而p21和p27的表達(dá)明顯升高，E2F1的表達(dá)顯著降低。以上結(jié)果表明RASSF1A主要通過升高p21、p27和降低E1F2的表達(dá)，抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。

Figure 1. H446 cells transfected with RASSF1A gene were constructed and RASSF1A expression was detected (×100). A, B: the pictures of H446 cells after transfection for 96 h; C,D: the clones that stably expressed RASSF1A were obtained; E: RASSF1A was detected when H446 cells were infected by lentivirus containing RASSF1A gene.

95%以上的小細(xì)胞肺癌，由于Rb基因表達(dá)缺失，放松了對(duì)E2F1的管制。持續(xù)活化的E2F1促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的持續(xù)表達(dá)，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[4]。p21和p27作為細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑，主要是抑制了Cdk2/cyclin E的活性，從而抑制轉(zhuǎn)錄因子FoxO1活性，抑制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[5]。RASSF1A通過促進(jìn)p21和p27的表達(dá)，可能抑制了FoxO1的活性；同時(shí)還直接抑制了轉(zhuǎn)錄因子E2F1的表達(dá)，導(dǎo)致促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的降低，抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)，使細(xì)胞停滯在G1期。

Figure 2. The growth curve and cell cycle of RASSF1A cells. A: the growth curve was detected by MTT assay; B: the cell cycle was analyzed by flow cytometry.Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs normal or LV-GFP.

RASSF1A作為一個(gè)抑癌蛋白，其抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制被廣泛探討。RASSF1A蛋白羧基末端的Ras蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域能夠與Ras蛋白相互結(jié)合，進(jìn)而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)[2]。還有文獻(xiàn)報(bào)道，RASSF1A能夠抑制cyclin D1在細(xì)胞內(nèi)的聚集，進(jìn)而影響細(xì)胞周期的順利進(jìn)行[6]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)RASSF1A在小細(xì)胞肺癌中也發(fā)揮抑癌作用，其抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的主要作用機(jī)制是促進(jìn)p21和p27的表達(dá)，同時(shí)降低E2F1的表達(dá)，進(jìn)而使細(xì)胞周期阻滯在G1期，抑制細(xì)胞的增殖，以上結(jié)果為小細(xì)胞肺癌基因治療提供新的靶點(diǎn)。

Figure 3. The mRNA (A) and protein (B) levels of cell cycle-associated proteins detected by real-time PCR and Western blotting. Mean±SD. n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs normal or LV-GFP.

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] 鄒 敏，周韶璋，于起濤，等. 非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織和血清表皮生長(zhǎng)因子受體第19、21外顯子的檢測(cè)及其臨床特征的分析[J].中國(guó)病理生理雜志，2013,29(5)：839-844.

[2] Dittfeld C, Richter AM, Steinmann K, et al. The SARAH domain of RASSF1A and its tumor suppressor function[J]. Mol Biol Int, 2012,2012: 196715.

[3] Dammann R, Yang G， Pfeifer GP. Hypermethylation of the CpG island of Ras association domain family 1A (RASSF1A), a putative tumor suppressor gene from the 3p21.3 locus, occurs in a large percentage of human breast cancers[J]. Cancer Res, 2001, 61(7):3105-3109.

[4] Li J, Hu SX, Perng GS, et al. Expression of the retinoblastoma (RB) tumor suppressor gene inhibits tumor cell invasioninvitro[J]. Oncogene, 1996, 13(11): 2379-2386.

[5] Lin SY, Black AR, Kostic D, et al. Cell cycle-regulated association of E2F1 and Sp1 is related to their functional interaction[J]. Mol Cell Biol, 1996, 16(4):1668-1675.

[6] Shivakumar L, Minna J, Sakamaki T, et al. The RASSF1A tumor suppressor blocks cell cycle progression and inhibits cyclin D1 accumulation[J]. Mol Cell Biol,2002,22(12):4309-4318.