石金鳳，劉小紅，汪浩宇，劉小琴，王志堅(jiān)

(西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，水產(chǎn)科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715)

血液是動(dòng)物體內(nèi)十分重要的組織，除了物質(zhì)循環(huán)和運(yùn)輸外，血細(xì)胞還承擔(dān)了免疫應(yīng)答、損傷修復(fù)等多種功能[1]。魚類的血液對(duì)外界環(huán)境十分敏感，通過對(duì)魚體血液的檢測分析，可以了解到魚類的健康狀態(tài)及其生活環(huán)境狀況[2-3]。魚類是脊椎動(dòng)物數(shù)量最大的類群，而目前對(duì)于魚類血細(xì)胞的研究主要集中在鯉形目、鱸形目和鲇形目的部分物種，如斑馬魚(Danio rerio)、鯉(Cyprinus carpio)、淇河鯽(Carassius auratus)、軍曹魚(Rachycentron canadum)、點(diǎn)帶石斑魚(Epinephelus malabaricus)以及長吻鮠(Leiocassis longirostris)、南方鲇(Silurus meridionalis)等。然而由于不同魚類生活環(huán)境的差異，不同魚類血細(xì)胞在形態(tài)、功能、發(fā)生上可能存在較大差異。除了斑馬魚[4]、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[5]的血細(xì)胞和免疫系統(tǒng)方面有較深入的研究外，多數(shù)魚類的有關(guān)研究還只能依賴于細(xì)胞學(xué)特征進(jìn)行分類，然后利用這些基礎(chǔ)研究開展深入研究。因此，為了開展魚類資源的保護(hù)和開發(fā)利用，對(duì)于有潛在經(jīng)濟(jì)價(jià)值和科研價(jià)值的魚類，有必要開展基礎(chǔ)的血液學(xué)相關(guān)研究，為其將來的規(guī)?；?biāo)準(zhǔn)化、科學(xué)化人工養(yǎng)殖及健康評(píng)估提供參考。

四川華鳊(Sinibrama taeniatus)隸屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)鲌亞科(Cultrinae)華鳊屬(Sinibrama)，是長江上游特有的一種小型經(jīng)濟(jì)魚類，具有重要的經(jīng)濟(jì)與生態(tài)價(jià)值。但由于其分布范圍狹窄以及人為捕撈和水利設(shè)施修建等原因?qū)е沦Y源量持續(xù)下降[6]。有關(guān)四川華鳊的研究主要集中在年齡與生長[7]、胚胎發(fā)育[8-9]以及性腺發(fā)育[10]等方面。并且在本實(shí)驗(yàn)室研究中發(fā)現(xiàn)，達(dá)到性成熟后的四川華鳊在適宜的養(yǎng)殖條件下可14 d 繁殖一次，打破了其在野外環(huán)境下一年僅繁殖2 次的繁殖周期，具有重要的研究價(jià)值。魚類的存活與其免疫系統(tǒng)息息相關(guān)，但目前對(duì)于四川華鳊血細(xì)胞以及免疫相關(guān)的研究還未見報(bào)道。本研究利用外周血涂片法和組織印片法，觀察四川華鳊頭腎、體腎、脾臟和肝臟4 種造血器官中血細(xì)胞的類型以及各類型間的數(shù)量比例，旨在了解四川華鳊血細(xì)胞的類型組成、各造血器官的造血功能以及血細(xì)胞發(fā)生的特征以及免疫系統(tǒng)的基本構(gòu)成，促進(jìn)四川華鳊的科學(xué)化人工養(yǎng)殖技術(shù)的建立，為推動(dòng)長江特有魚類資源的保護(hù)提供基礎(chǔ)的生理資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用四川華鳊來自西南大學(xué)淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室大棚循環(huán)水養(yǎng)殖缸。挑選體表無損傷，體色正常，健康活潑的12 尾四川華鳊[體長(8.6±0.8) cm，體重(9.5±0.4) g]轉(zhuǎn)移至室內(nèi)養(yǎng)殖缸中馴養(yǎng)7 d[11]，馴養(yǎng)水為曝氣24 h 的自來水，水溫(25±0.5) °C，并利用充氣泵增氧，每日定時(shí)2 次投喂餌料。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)用四川華鳊經(jīng)MS-222(格林恒興，北京)麻醉后，使用肝素鈉處理過的1 mL 無菌注射器進(jìn)行尾靜脈采血[12]，并制作外周血涂片[13]。采血后迅速解剖魚體，分別取出肝臟、體腎、頭腎和脾臟，0.65%生理鹽水沖洗后，制作組織印片[13]。每個(gè)器官的每個(gè)切面印5 個(gè)印跡。待涂片與印片自然風(fēng)干后，甲醇固定，Wright's-Giemsa 染色液(索萊寶，北京)染色，中性樹脂封片，40 ℃烘箱干燥。

干燥后的裝片于Eclipse 80i(Nikon，日本)顯微成像系統(tǒng)下觀察、計(jì)數(shù)、拍照。每尾魚選取3張制作良好，染色均勻的外周血涂片，每張血涂片隨機(jī)選取100 個(gè)白細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。每尾魚的頭腎、體腎、脾臟、肝臟的組織印片于100 倍鏡下各拍30 個(gè)視野，參照《野生動(dòng)物血液細(xì)胞學(xué)圖譜》[14]將各種細(xì)胞劃分為原始型、幼稚型、成熟型3 個(gè)發(fā)育階段，分類計(jì)數(shù)并計(jì)算出各類細(xì)胞在總細(xì)胞中的占比。Image J 測量各類血細(xì)胞及不同發(fā)育階段各類型血細(xì)胞的胞體長短徑以及胞核長短徑，每種細(xì)胞測量100 個(gè)，使用SPSS 20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 四川華鳊外周血細(xì)胞組成

成熟紅細(xì)胞是四川華鳊外周血主要細(xì)胞類型，淋巴細(xì)胞、血栓細(xì)胞、單核細(xì)胞以及嗜中性粒細(xì)胞等較少(圖版Ⅰ)，可偶見漿細(xì)胞(圖版Ⅰ-15)，未觀察到嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞。四川華鳊外周血中還發(fā)現(xiàn)有少量處于晚幼階段的紅細(xì)胞(圖版Ⅰ-9)；并可觀察到紅細(xì)胞分裂現(xiàn)象(圖版Ⅰ-2～4)。未觀察到其他類型的未成熟血細(xì)胞。

圖版Ⅰ 外周血涂片中各類型血細(xì)胞1.成熟的紅細(xì)胞；2～3.正在分裂的紅細(xì)胞(胞質(zhì)分裂,胞核不分裂)；4.正在分裂的紅細(xì)胞(胞核胞質(zhì)均分裂)；5.衰老的紅細(xì)胞；6.紅細(xì)胞胞質(zhì)小體；7.晚幼紅細(xì)胞；8.大淋巴細(xì)胞；9.小淋巴細(xì)胞；10.血栓細(xì)胞(蝌蚪形和長橢圓形)；11.單核細(xì)胞；12.分葉的單核細(xì)胞；13.嗜中性粒細(xì)胞；14.分葉的嗜中性粒細(xì)胞；15.漿細(xì)胞。Plate Ⅰ All kinds of blood cells in the peripheral blood smears1.erythrocyte;2-3.dividing of erythrocyte (the cytoplasm divides but the nucleus does not divide);4.dividing of erythrocyte (the cytoplasm and nucleus divide equally);5.old erythrocyte;6.erythroid plastid;7.orthochromatic erythroblast;8.large lymphocyte;9.small lymphocyte;10.thrombocyte (tadpole shaped and long oval shaped);11.monocyte;12.monocyte segmented cell;13.neutrophil;14.neutrophil segmented cell;15.plasmocyte.

測量各類血細(xì)胞的大小，并統(tǒng)計(jì)各類白細(xì)胞占比(表1)。從表1 可以看出，從細(xì)胞長徑看，紅細(xì)胞最大；從細(xì)胞大小、短徑和核徑看，都是單核細(xì)胞最大，小淋巴細(xì)胞最小。紅細(xì)胞長短徑比值在1.69～1.88。白細(xì)胞中淋巴細(xì)胞占比最高，為65.79%±0.10%；其次是血栓細(xì)胞，占16.76%±0.07%；再次為嗜中性粒細(xì)胞，占13.92%±0.09%；單核細(xì)胞含量少，僅有3.33%±0.01%。

表1 四川華鳊外周血細(xì)胞數(shù)量百分比及細(xì)胞大小Tab.1 Differential leucocytes counts (DLC) and the sizes of different blood cells

2.2 各類血細(xì)胞不同發(fā)育階段的形態(tài)特征

通過4 種器官的印片觀察，可將血細(xì)胞分為紅細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞4 個(gè)細(xì)胞系；每種血細(xì)胞又可分為原始型、幼稚型、成熟型3 個(gè)發(fā)育階段；但具體階段又有所差異，各細(xì)胞在形態(tài)和細(xì)胞大小上有較大差異(圖版Ⅱ，表2)。

表2 四川華鳊各類血細(xì)胞大小Tab.2 The sizes of different blood cells of S.taeniatus

紅細(xì)胞系 紅細(xì)胞的發(fā)育可分為原紅細(xì)胞(proerythroblast,PEB)、早幼紅細(xì)胞(basophilic erythroblast,BE)、晚幼紅細(xì)胞(orthochromatic erythroblast,OE)和成熟紅細(xì)胞(erythrocyte,ER) 4個(gè)階段。

原紅細(xì)胞近圓形，邊緣不規(guī)則，偶爾可見邊緣有偽足狀突起。胞體長徑為(11.05±0.52) μm，短徑為(9.48±0.72) μm。胞漿量少，染為深藍(lán)色。胞核大，占胞體大部，多呈較規(guī)則的圓形，胞核長徑(8.11±0.89) μm，胞核短徑(6.15±0.68) μm。胞內(nèi)核質(zhì)呈顆粒狀，排列疏松，染為紫紅色(圖版Ⅱ-1)。

早幼紅細(xì)胞近圓形，部分有偽足狀的突起，胞體長徑(10.46±0.74) μm，胞體短徑(9.07±0.97) μm，胞漿染為藍(lán)色。胞核圓形，多偏位，胞核長徑(7.11±0.99) μm，胞核短徑(5.30±0.80) μm。相對(duì)原紅細(xì)胞而言胞核凝縮變小，染色質(zhì)粗糙密集成塊，染為淺紫紅色(圖版Ⅱ-2)。

晚幼紅細(xì)胞多為規(guī)則圓形，胞體縮小，是紅細(xì)胞發(fā)育過程中胞體最小的發(fā)育階段。胞體長徑(8.28±1.02) μm，胞體短徑(7.46±0.66) μm。胞漿中已有大量血紅蛋白的合成，染成橘紅偏灰色。胞核圓形居中，胞核凝縮，胞核長徑(5.41±0.73) μm，胞核短徑(4.54±0.81) μm，染為深紫色(圖版Ⅱ-3)。

成熟紅細(xì)胞呈長橢圓形或近卵圓形，胞體較大，其長徑為(11.76±0.83) μm，短徑為(6.40±0.57)μm。胞漿豐富，內(nèi)部充滿血紅蛋白，染色為橘紅色或淺紅色，顏色均勻。胞核呈橢圓形，胞核長徑為(4.82±0.53) μm，短徑為(2.27±0.32) μm，核居中，染色質(zhì)交織成網(wǎng)致密排布，染為藍(lán)紫色(圖版Ⅱ-4)。

淋巴細(xì)胞系 淋巴細(xì)胞的發(fā)育包括了原淋巴細(xì)胞(lymphoblast,LB)、幼淋巴細(xì)胞(prolymphocyte,PL)和成熟淋巴細(xì)胞(mature lymphocyte,ML)3 個(gè)階段。

原淋巴細(xì)胞呈規(guī)則圓形或卵圓形，邊緣平整。胞體長徑(10.03±0.56) μm，胞體短徑(8.97±0.67) μm，是血細(xì)胞系中原始細(xì)胞最小的一類。胞漿少，染為藍(lán)色或亮藍(lán)色，在胞核與胞漿交界處常有一圈狹窄的環(huán)核帶。胞核圓形居中或稍偏位，核質(zhì)比大，胞核長徑(7.44±0.84) μm，胞核短徑(6.20±0.88) μm，染為紫紅色，核染質(zhì)交織呈網(wǎng)狀排布(圖版Ⅱ-5)。

幼淋巴細(xì)胞類圓形，胞體長徑(8.54±0.70) μm，胞體短徑(7.21±0.67) μm。胞漿較少，染為淡藍(lán)色。部分細(xì)胞胞漿內(nèi)含有紫紅色嗜天青顆粒。胞核圓形或不規(guī)則類圓形，居中或偏位與質(zhì)膜相切，胞核長徑(5.97±0.62) μm，胞核短徑(4.78±0.70) μm，核染色質(zhì)相對(duì)聚集濃縮，染為淺紫紅色(圖版Ⅱ-6)。

成熟淋巴細(xì)胞根據(jù)大小可分為大淋巴細(xì)胞(large lymphocyte,LL)和小淋巴細(xì)胞(small lymphocyte,SL)。大淋巴細(xì)胞多呈圓形，偶爾可見偽足。胞體長徑(5.53±0.66) μm，胞體短徑(4.48±0.67)μm，胞漿較少，染成藍(lán)色。胞核呈圓形或橢圓形，長徑(4.05±0.51) μm，短徑(3.20±0.66) μm，核染色質(zhì)濃縮致密，呈較深的紫紅色(圖版Ⅱ-7)。小淋巴細(xì)胞長徑為(4.21±0.50) μm，短徑為(3.43±0.50) μm。胞體呈類圓形，常有偽足伸出。胞漿量極少，胞漿為淡藍(lán)色。胞核圓形居中，胞核長徑(3.21±0.50) μm，胞核短徑(2.60±0.47) μm，染為深紫紅色，相對(duì)大淋巴細(xì)胞而言，核染質(zhì)更加凝縮，染色更深(圖版Ⅱ-8)。

粒細(xì)胞系 粒細(xì)胞的發(fā)育分為原粒細(xì)胞(myeloblast,MYB)、早幼粒細(xì)胞(promyelocyte,PML)、中幼粒細(xì)胞(myelocyte,MYC)、晚幼粒細(xì)胞(metamyelocyte,MML)和成熟粒細(xì)胞(mature granulocyte,MG)。嗜中性粒細(xì)胞經(jīng)歷原粒細(xì)胞、早幼粒細(xì)胞、中性中幼粒細(xì)胞(neutrophilic myelocyte,NM)、中性晚幼粒細(xì)胞(neutrophilic metamyelocyte，NMM)和成熟的嗜中性粒細(xì)胞(neutrophil,NE)5 個(gè)階段。

原粒細(xì)胞為圓形或卵圓形，邊緣整齊，較原紅細(xì)胞大，胞體長徑(11.60±0.61) μm，胞體短徑(10.19±0.87) μm。胞漿較少，染色為著色均勻的深藍(lán)色。胞核圓形或橢圓形，多居中也有偏位的現(xiàn)象，核質(zhì)比較大，胞核長徑(8.63±0.77) μm，胞核短徑(6.97±1.08) μm。核染色質(zhì)呈微細(xì)顆粒狀排布，染為淺藍(lán)紫色(圖版Ⅱ-9)。

早幼粒細(xì)胞呈圓形或橢圓形，胞體長徑(10.68±0.98) μm，胞體短徑(9.56±0.92) μm，胞漿量較多，呈天藍(lán)色，存在紫紅色的嗜天青顆粒。胞核多為橢圓形，位于中央或稍偏位，胞核長徑(7.30±0.80) μm，胞核短徑(4.87±1.12) μm，胞核逐漸縮小，核染質(zhì)有凝集趨勢，胞核染為較深的粉紫色(圖版Ⅱ-10)。

中性中幼粒細(xì)胞為圓形或類圓形，胞體長徑(10.42±0.79) μm，胞體短徑(9.70±0.71) μm。胞漿量多，呈藍(lán)粉色且充滿紫紅色顆粒。核染色質(zhì)進(jìn)一步固縮，胞核縮小，胞核長徑(7.23±0.63) μm，胞核短徑(4.82±0.51) μm。胞核圓形或類圓形，居中或偏位，染為紫紅色(圖版Ⅱ-11)。

中性晚幼粒細(xì)胞為圓形或類圓形，胞體長徑(11.19±0.99) μm，胞體短徑(10.02±1.05) μm。胞漿量多，胞漿與中幼嗜中性粒細(xì)胞相似，染色為淡紅色，含有豐富的紫紅色顆粒。胞核呈腎形或卵圓形，胞核長徑(7.27±1.21)，胞核短徑(4.45±1.25)。核染色質(zhì)較粗糙交織成粗粒網(wǎng)狀，染成深紫色(圖版Ⅱ-12)。

成熟的嗜中性粒細(xì)胞圓形或長卵圓形，胞體長徑(10.82±1.57) μm，胞體短徑(9.61±1.25) μm，胞漿豐富，胞漿內(nèi)有細(xì)小的紫紅色中性特異性顆粒。胞核呈圓形、腎形，有時(shí)有分葉，偏位與質(zhì)膜相切，胞核大小一般為胞體的三分之一，胞核長徑(7.22±1.00) μm，胞核短徑(4.49±0.22) μm，核染色質(zhì)固縮粗糙形成顆粒網(wǎng)狀(圖版Ⅱ-13)。

單核細(xì)胞系 單核細(xì)胞的發(fā)育包括了原單核細(xì)胞(monoblast,MB)、幼單核細(xì)胞(promonocyte,PM)和成熟單核細(xì)胞(monocyte,MO) 3 個(gè)階段。

原單核細(xì)胞呈圓形、橢圓形或不規(guī)則形，胞體相對(duì)其他的原始血細(xì)胞大，其胞體長徑(14.41±1.20) μm，胞體短徑(11.56±1.38) μm，染為較深的藍(lán)色或灰藍(lán)色。胞核形態(tài)多樣，為長橢圓形、腎形或不規(guī)則形狀，胞核長徑(10.09±1.38) μm，胞核短徑(7.54±1.24) μm。胞核染色質(zhì)呈疏松纖細(xì)網(wǎng)狀，染為淡紫紅色(圖版Ⅱ-14)。

幼單核細(xì)胞為長橢圓形或不規(guī)則形，胞體長徑為(13.73±0.75) μm，胞體短徑(11.26±0.94) μm，胞漿量多，偶見空泡，呈天藍(lán)色或淺藍(lán)色。胞核形狀多為不規(guī)則形或長橢圓形，多偏位。胞核相較原單核細(xì)胞較小，胞核長徑(8.80±1.15) μm，胞核短徑(6.32±0.81) μm，核染色質(zhì)逐漸凝縮成疏松網(wǎng)狀，染為淺紫紅色(圖版Ⅱ-15)。

圖版Ⅱ 四川華鳊血細(xì)胞發(fā)生過程Plate Ⅱ Hematocytes in different developmental stage in S.taeniatus

成熟單核細(xì)胞多為圓形或橢圓形，也有不規(guī)則形狀，有時(shí)出現(xiàn)偽足。胞體是所有成熟血細(xì)胞中最大的一種。胞體長徑為(12.43±0.87) μm，胞體短徑為(10.42±1.07) μm，胞質(zhì)淡藍(lán)色或灰藍(lán)色，少數(shù)有空泡。胞核有圓形、腎形、不規(guī)則形等，偶見分葉，多偏向一側(cè)與質(zhì)膜相切；胞核較大，可占到整個(gè)細(xì)胞的三分之一甚至二分之一，胞核長徑為(8.36±1.27) μm，胞核短徑為(5.86±0.92) μm。核染色質(zhì)粗糙，分布濃密，呈粗糙疏網(wǎng)狀，染成較深的紅紫色(圖版Ⅱ-16)。

其他細(xì)胞 血栓細(xì)胞(Thrombocyte,THR)一般呈長橢圓形或蝌蚪形，體積較小，胞體長徑(7.39±0.97) μm，胞體短徑(3.66±0.64) μm。胞漿少，染色均勻，呈淡藍(lán)色，有時(shí)甚至無色。胞核也多為長棒狀或長橢圓形，胞核長徑(5.27±0.76) μm，胞核短徑(2.36±0.51) μm，核染色質(zhì)凝縮緊密，染成藍(lán)紫色(圖版Ⅰ-10)。

巨噬細(xì)胞(Macrophage,MP)由單核細(xì)胞發(fā)育而來的一類細(xì)胞[15]。胞體形狀不規(guī)則，有偽足，胞體長徑(17.16±1.81) μm，胞體短徑(12.88±1.66)μm，胞漿豐富，空泡多且大。胞漿染為不均勻的淡藍(lán)色且含有細(xì)小紫紅色顆粒。胞核圓形或不規(guī)則形，多偏位。胞核長徑(10.32±0.80) μm，胞核短徑(9.13±0.84) μm，核染色質(zhì)呈細(xì)網(wǎng)狀排布，染為淺紫色(圖版Ⅱ-17)。

漿細(xì)胞(Plasmocyte,PLA)呈橢圓形或卵圓形，邊緣不整齊并有偽足突出。胞體長徑(12.68±1.12)，胞體短徑(10.17±0.44)，胞漿染為深藍(lán)色。胞核橢圓形，胞核長徑(8.87±0.39)，胞核短徑(5.02±0.42)，核染色質(zhì)粗糙，凝縮成深紫紅色塊狀(圖版Ⅰ-15)。

2.3 四川華鳊血細(xì)胞的發(fā)生場所

為清晰展示四川華鳊的血細(xì)胞發(fā)生場所的差異，統(tǒng)計(jì)了4 種器官印片中各類血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)及百分比(表3)，發(fā)現(xiàn)在頭腎印片中，可見大量的處于不同發(fā)育階段的血細(xì)胞，處于原始階段以及幼稚階段的紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞和單核細(xì)胞都較為豐富(圖版Ⅲ-1)。體腎印片也可以發(fā)現(xiàn)很多處于不同發(fā)育階段的血細(xì)胞，但除原粒細(xì)胞外的各類原始細(xì)胞數(shù)量比頭腎少(圖版Ⅲ-2)。脾臟印片可觀察到大量的成熟紅細(xì)胞，在各類細(xì)胞中占比最高，而處于原始階段和幼稚階段的血細(xì)胞數(shù)量較少(圖版Ⅲ-3)。肝臟印片中各類血細(xì)胞的數(shù)量少于其他3 個(gè)組織器官，主要為成熟的紅細(xì)胞，除少數(shù)原淋巴細(xì)胞外，未發(fā)現(xiàn)其他原始血細(xì)胞(圖版Ⅲ-4)。

表3 四川華鳊四種器官印片中各類血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)及百分比Tab.3 The count and percentage of different blood cells in four organs of S.taeniatus

圖版Ⅲ 四種器官的印片1.頭腎印片；2.體腎印片；3.脾臟印片；4.肝臟印片。PEB.原紅細(xì)胞；BE.早幼紅細(xì)胞；ER.紅細(xì)胞；LB.原淋巴細(xì)胞；PL.幼淋巴細(xì)胞；LL.大淋巴細(xì)胞；SL.小淋巴細(xì)胞；MB.原單核細(xì)胞；MYB.原粒細(xì)胞；PML.早幼粒細(xì)胞；NM.中性中幼粒細(xì)胞；NMM.中性晚幼粒細(xì)胞；NE.嗜中性粒細(xì)胞；MP.巨噬細(xì)胞。Plate Ⅲ Four kinds of organ imprints1.pronephros imprint;2.body kidney imprint;3.liver imprint;4.spleen imprint.PEB.proerythroblast;BE.basophilic erythroblast;ER.erythrocyte;LB.lymphoblast;PL.prolymphocyte;LL.large lymphocyte;SL.small lymphocyte;MB.monoblast;MYB.myeloblast;PML.promyelocyte;NM.neutrophilic myelocyte;NMM.neutrophilic metamyelocyte;NE.neutrophil;MP.macrophage.

3 討論

3.1 四川華鳊外周血細(xì)胞特點(diǎn)

四川華鳊外周血細(xì)胞主要包括紅細(xì)胞和白細(xì)胞，后者包括淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞以及血栓細(xì)胞。在印片以及外周血中均未觀察到嗜堿性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞。大多數(shù)魚類具有嗜酸性粒細(xì)胞，僅有少數(shù)魚類如鯉[16]、軍曹魚[17]等觀察到少量嗜堿性粒細(xì)胞。脊椎動(dòng)物的血液中，嗜堿性粒細(xì)胞的嗜堿性顆粒易被酸中和，被水溶解，出現(xiàn)脫粒空白區(qū)，因此在制片過程中細(xì)胞易變形或破裂[14]，這一現(xiàn)象在軍曹魚[17]、長吻鮠[18]中均有發(fā)現(xiàn)。在四川華鳊外周血與4 種器官的印片中均未觀察到嗜堿性粒細(xì)胞，可能是由于其數(shù)量少，制片過程極易對(duì)其造成破壞導(dǎo)致。普遍認(rèn)為，外周血是成熟紅細(xì)胞的分布場所。但在四川華鳊的外周血中還含有正經(jīng)歷分裂的紅細(xì)胞以及少量處于幼稚階段的紅細(xì)胞，這種現(xiàn)象在軍曹魚[17]、大彈涂魚(Boleophthalmus pectinirostris)[19]、齊口裂腹魚(Schizothorax prenanti)[20]等中有發(fā)現(xiàn)。在四川華鳊的外周血中，觀察到兩種紅細(xì)胞的分裂方式，一種是核質(zhì)均等分裂產(chǎn)生2 個(gè)細(xì)胞，這與大彈涂魚[19]、淇河鯽[21]紅細(xì)胞直接分裂相似；另一種是胞質(zhì)分裂，胞核不分裂，產(chǎn)生有核的紅細(xì)胞和無核的胞質(zhì)小體，此種分裂方式與長吻鮠[18]紅細(xì)胞的直接分裂相同。但魚類紅細(xì)胞的兩種不同分裂方式在同一種魚中發(fā)生還未見報(bào)道。魚類的紅細(xì)胞被認(rèn)為是分化程度低，特化不完全的細(xì)胞[22]，其本身具有較好的再生能力；也有認(rèn)為出現(xiàn)直接分裂的紅細(xì)胞是細(xì)胞衰老的一種表征，胞質(zhì)分裂但胞核不分裂會(huì)產(chǎn)生衰老紅細(xì)胞和胞質(zhì)小體，最終被吞噬細(xì)胞吞噬[23]。但核質(zhì)均等分裂所產(chǎn)生的紅細(xì)胞是否為功能性細(xì)胞還需要進(jìn)一步的研究。因此，成熟紅細(xì)胞的直接分裂可能是四川華鳊的紅細(xì)胞增殖方式之一，但這種直接分裂的現(xiàn)象被觀察到的頻率極少，不是紅細(xì)胞主要的增殖方式。

四川華鳊的外周血中數(shù)量最多的是紅細(xì)胞。紅細(xì)胞的長短徑可以反映紅細(xì)胞的基本形態(tài)：比值越大，表明紅細(xì)胞越呈長橢圓形；比值越接近1，表明紅細(xì)胞越呈圓形。四川華鳊紅細(xì)胞長短徑比值在1.69～1.88，屬于典型的長橢圓形紅細(xì)胞。四川華鳊各類白細(xì)胞比例差異為淋巴細(xì)胞>血栓細(xì)胞>嗜中性粒細(xì)胞>單核細(xì)胞，以淋巴細(xì)胞為主要的白細(xì)胞類群，這一特性與鳙(Aristichthys nobilis)[24]、花斑裸鯉(Gymnocypris eckloni)[25]相同；而麥穗魚(Pseudorasbora parva)[26]、齊口裂腹魚[20]、瓦氏黃顙魚(Pelteobagrus vachelli)[27]等其白細(xì)胞類群以血栓細(xì)胞為主。淋巴細(xì)胞主要的功能是產(chǎn)生抗體參與免疫應(yīng)答，血栓細(xì)胞除了凝血功能外還具有吞噬和其他可能的免疫功能[28-29]。外周血中淋巴細(xì)胞和血栓細(xì)胞含量的差異與魚體免疫能力的關(guān)系還需進(jìn)一步研究。

3.2 魚類血細(xì)胞發(fā)育過程

各類血細(xì)胞在發(fā)育的過程中都會(huì)經(jīng)歷細(xì)胞大小和細(xì)胞內(nèi)容物的變化過程。四川華鳊從原紅細(xì)胞發(fā)育到幼紅細(xì)胞的過程為胞體體積逐漸變小，而在幼紅細(xì)胞發(fā)育成熟過程中則又逐步變大，這與紫紅笛鯛(Lutjanus argentimaculatus)[30]等的紅細(xì)胞在發(fā)育中一直變小不同，但與軍曹魚[17]、美國紅魚(Sciaenops ocellatus)[31]、施氏魮(Barbonymus schwanenfeldii)[11]等的發(fā)育過程相一致。四川華鳊兩類淋巴細(xì)胞的大小在發(fā)育過程中逐漸減小的現(xiàn)象與美國紅魚[31]、軍曹魚[17]等相同，而與淡水石斑魚(Cichlasoma managuense)[32]的由小變大再變小不同。四川華鳊單核細(xì)胞胞體在發(fā)育過程中也是由大變小，這種變化以及細(xì)胞染色狀態(tài)的變化與長吻鮠[23]、施氏魮[11]等相同。四川華鳊粒細(xì)胞的發(fā)育過程中，細(xì)胞大小則表現(xiàn)為先變小后變大再變小，這種現(xiàn)象與點(diǎn)帶石斑魚[33]等粒細(xì)胞發(fā)育過程相同，但與紫紅笛鯛[30]、南方鲇[34]等表現(xiàn)出胞體一直變小不同。就目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)不同種魚的各類血細(xì)胞的發(fā)育均具有相同的變化特征的現(xiàn)象，這說明魚類血細(xì)胞的發(fā)育具有物種特異性。

嗜天青顆粒被認(rèn)為是初級(jí)溶酶體，含有多種水解酶，能消化分解異物，是免疫細(xì)胞發(fā)揮功能的關(guān)鍵細(xì)胞器之一[35]。與長吻鮠[18]相似，四川華鳊少數(shù)幼淋巴細(xì)胞和成熟淋巴細(xì)胞內(nèi)含有紫紅色的嗜天青顆粒，且成熟階段更多。除了淋巴細(xì)胞，未成熟粒細(xì)胞也都有相似的現(xiàn)象。已有研究認(rèn)為，小鼠(Mus musculus)體內(nèi)白細(xì)胞隨著發(fā)育階段的推進(jìn)，細(xì)胞中參與活性氧產(chǎn)生、吞噬和趨化的關(guān)鍵基因表達(dá)逐漸增強(qiáng)，細(xì)胞免疫功能逐步增強(qiáng)[36]。因此，魚類未成熟白細(xì)胞也可能就已經(jīng)具有免疫功能，并隨著發(fā)育階段的推進(jìn)而增強(qiáng)。

3.3 魚類血細(xì)胞發(fā)生的場所

除了血細(xì)胞的發(fā)育過程，魚類各類血細(xì)胞的發(fā)生場所，也存在一定的種間差異性。南方鲇[34]的肝臟和脾臟是紅細(xì)胞發(fā)生的主要場所，淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞主要發(fā)生在頭腎和體腎；軍曹魚[17]的頭腎和中腎是主要的血細(xì)胞發(fā)生場所，脾臟主要產(chǎn)生粒細(xì)胞，肝臟也能產(chǎn)生粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。而在紫紅笛鯛[30]體內(nèi)，頭腎、體腎和脾臟都是重要的血細(xì)胞發(fā)生場所，但肝臟無造血功能。各器官中各類原始血細(xì)胞含量的差異可反映其造血能力的強(qiáng)弱[37]。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)中觀察統(tǒng)計(jì)的結(jié)果(表3)可判斷，頭腎、體腎、脾臟都是四川華鳊的造血器官，但也具有一定分工。頭腎是含有原紅細(xì)胞、原淋巴細(xì)胞、原單核細(xì)胞數(shù)量最多的器官，是四川華鳊最重要的血細(xì)胞發(fā)生場所；體腎印片中，原粒細(xì)胞含量比頭腎多，因此體腎是粒細(xì)胞發(fā)生的主要場所，但也在頭腎大量發(fā)生，脾臟內(nèi)少量產(chǎn)生。在脾臟印片中觀察到的成熟紅細(xì)胞數(shù)量最多，占各階段紅細(xì)胞總和的94.68%，但原始階段數(shù)量極少，說明脾臟是四川華鳊極重要的儲(chǔ)血器官。在肝臟印片中能觀察到原淋巴細(xì)胞，說明肝臟也具有一定的造血功能，但局限于少數(shù)淋巴細(xì)胞的發(fā)生。肝臟中僅觀察到一定幼稚階段和較多成熟階段的紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞，提示幼稚階段的血細(xì)胞形成后可遷移至其他造血器官并逐漸發(fā)育成熟。由此可見，頭腎、腎臟和脾臟為魚類普遍性的造血場所，但肝臟是否有造血功能以及其造血能力的強(qiáng)弱具有很大的物種差異性。另外，各類造血器官在造血的功能上既可以團(tuán)結(jié)協(xié)作，又有較為明確的分工，這種分工具有物種差異性。

（作者聲明本文無實(shí)際或潛在的利益沖突）