袁偉偉， 林秋雄， 朱杰寧， 李曉紅， 符永恒， 劉曉穎， 譚虹虹， 鄧春玉， 單志新

(廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院, 廣東省心血管病研究所，廣東 廣州 510080)

急性心肌梗死仍是世界公共衛(wèi)生一大難題，現(xiàn)有治療方法的療效有限。心肌細(xì)胞治療是一種再生、修復(fù)損傷心肌的治療策略。已有很多不同組織來(lái)源的干細(xì)胞、祖細(xì)胞被用于實(shí)驗(yàn)性或臨床治療研究，如胚胎干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、造血干細(xì)胞、新生兒或胎兒心臟干細(xì)胞、骨骼肌成肌細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPS cells)等[1-4]。MSCs是一種具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，可以在不同的誘導(dǎo)條件下分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等，可能是組織工程、再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中重要的種子細(xì)胞[5]。MSCs已在臨床前研究中得到了廣泛的測(cè)試，并且已有幾個(gè)臨床試驗(yàn)評(píng)估其在心肌梗死治療中的臨床療效[6-9]。然而，由于梗死心肌中缺血、炎癥等惡劣的微環(huán)境使得MSCs的移植率和存活率低下，大大限制了MSCs的治療效果。近年來(lái)，人們嘗試通過(guò)基因修飾MSCs來(lái)提高其移植后的存活率，并取得了一定的效果；已報(bào)道用于修飾MSCs的基因包括Bcl-2、間隙連接蛋白43 (connexin-43)、血紅素氧合酶 (heme oxygenase-1,HO-1)、熱休克蛋白20 (heat-shock protein 20, HSP-20)、磷脂酰肌醇3-激酶C2α(phosphatidylinositol 3-kinases C2α, PI3K-C2α)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)和血管生成素1(angiopoietin-1,Ang1)等[10]。

鑒于過(guò)表達(dá)抗凋亡蛋白可增強(qiáng)MSCs的心肌再生作用[11-13]，我們認(rèn)為通過(guò)沉默促凋亡基因表達(dá)也可以提高M(jìn)SCs的存活率。本研究制備了表達(dá)人caspase-8小發(fā)夾RNA(small hairpin RNA,shRNA)的重組腺病毒，檢測(cè)了腺病毒介導(dǎo)的caspase-8 shRNA對(duì)人MSCs中caspase-8表達(dá)的抑制作用及對(duì)去血清/缺氧誘導(dǎo)的MSCs凋亡的保護(hù)作用。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞和載體

hMSCs按我們已報(bào)道的方法分離、培養(yǎng)和保存[14]；HEK293T購(gòu)自ATCC；質(zhì)粒pAdTrack-CMV(攜帶GFP報(bào)告基因)、pAdEasy-I和大腸桿菌菌株BJ5183購(gòu)自Stratagen；大腸桿菌菌株DH-5α由本研究室保存。

2 主要試劑

質(zhì)粒提取試劑盒和DNA 回收試劑盒(Qiagen)；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄酶和定量PCR Master Mix購(gòu)自Invitrogen；DNA聚合酶和限制性?xún)?nèi)切酶(TaKaRa)；胎牛血清和α-DMEM(HyClone)；L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、磷酸鹽緩沖液(PBS)、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、293 FectinTM轉(zhuǎn)染試劑和0.05% 胰蛋白酶、annexin V/PI(Invitrogen)；caspase-8活性檢測(cè)試劑(Promega)；caspase-8抗體和GAPDH抗體(Abcam)；所用PCR引物由英濰捷基(上海)公司合成。

3 主要方法

3.1PCR擴(kuò)增法制備caspase-8 shRNA編碼DNA 參考我們已報(bào)道方法[15]，簡(jiǎn)述如下。分別針對(duì)人caspase-8基因的2個(gè)靶序列：aagggtcatgctctatcagat和cagtgccagacacagtctgta，并根據(jù)腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV 多克隆位點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)合成用于制備基于微小RNA-155骨架序列(back bone)的caspase-8 shRNA模板DNA的PCR引物。靶向aagggtcatgctctatcagat的caspase-8 shRNA模板DNA的PCR上游引物ATGCGGTACCTGAAGGCTTGCTGTAGGCTGTATG-CTGATCTGATAGAGCATGACCCTTGTTTTGGCCACT-GACTGAC (KpnI)，下游引物GCATAAGCTTCAGCAATTTGTTCCATGTGAATGCTAGTAACAGGCATCA-TACACTGATCTGATAGAGTGACCCTTGTCAGTCAGT-GGCCAAAAC (HindIII)。靶向cagtgccagacacagtctgta的caspase-8 shRNA模板DNA的PCR上游引物ATGCGGTACCTGAAGGCTTGCTGTAGGCTGTATGCTGT-ACAGACTGTGTCTGGCACTGGTTTTGGCCACTGACT-GAC (KpnI)，下游引物GCATAAGCTTCAGCAATTTGTTCCATGTGAATGCTAGTAACAGGCATCATACACTG TACAGACTGTGTGGCACTGGTCAGTCAGTGGCCAA-AAC (HindIII)。分別利用2對(duì)PCR引物自身為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，條件為94 ℃ 2 min，后連續(xù)31個(gè)循環(huán), 每個(gè)循環(huán)內(nèi)94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 15 s, 完成最后1個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸3 min。之后進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳, 用凝膠提取試劑盒純化PCR 產(chǎn)物。

3.2人caspase-8 shRNA腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建 用KpnI+HindIII分別酶切人caspase-8 shRNA模板DNA和pAdTrack-CMV質(zhì)粒。純化酶切產(chǎn)物, 利用T4DNA連接酶于16 ℃反應(yīng)4～6 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α, 鋪50 mg /L Kana+/LB平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。對(duì)獲得的陽(yáng)性克隆重組質(zhì)粒行KpnⅠ+HindIII酶切和DNA測(cè)序鑒定。

3.3細(xì)菌內(nèi)同源重組獲得caspase-8 shRNA重組腺病毒質(zhì)粒 用PmeⅠ酶切重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-caspase-8 shRNA，然后將線(xiàn)性化質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-I共轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)菌，鋪50 mg/L Kana+/LB平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。用堿裂解法提取擴(kuò)增后的最小陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒DNA, 分別行PCR和PacⅠ酶切鑒定。將鑒定正確的重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)DH5α菌, 挑取克隆擴(kuò)增, 提取質(zhì)粒保存。

3.4Caspase-8 shRNA重組腺病毒在HEK293細(xì)胞中的包裝及擴(kuò)增 用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)人胚腎293細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染前24 h, 將106HEK293細(xì)胞鋪于25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。當(dāng)細(xì)胞豐度達(dá)到60%～70%時(shí), 用293fectinTM試劑將PacI線(xiàn)性化的caspase-8 shRNA重組腺病毒質(zhì)粒導(dǎo)入HEK293細(xì)胞。培養(yǎng)24～48 h后，在熒光顯微鏡下觀(guān)察重組腺病毒上共表達(dá)的綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)。繼續(xù)培養(yǎng)7～10 d后，用吸管小心吹打收集293細(xì)胞及上清培養(yǎng)基。在-70 ℃/37 ℃反復(fù)凍融裂解細(xì)胞3次后，用適量的細(xì)胞凍融裂解上清液再次感染HEK293細(xì)胞。2～3 d后，按照上述方法收集病毒上清，經(jīng)過(guò)2～3次重復(fù)擴(kuò)增后，獲得較高滴度的重組病毒。按上述方法，制備只表達(dá)標(biāo)志蛋白GFP的對(duì)照重組腺病毒rAd-GFP。用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液稀釋高滴度的重組病毒，以不同感染復(fù)數(shù)(MOI值)感染hMSCs，以感染后24 h GFP表達(dá)確定合適的病毒感染MOI。

3.5去血清/缺氧處理hMSCs 將hMSCs鋪板24 h后至穩(wěn)定生長(zhǎng)。更換為無(wú)血清培養(yǎng)基(N2飽和0.5 h)在0.1% O2、37 ℃培養(yǎng)6 h，更換完全培養(yǎng)基，在常氧，5% CO2、37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)18 h。

3.6熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá) 用Trizol 試劑提取hMSCs總RNA，用2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，進(jìn)行目的基因表達(dá)水平的定量檢測(cè)。Real-time PCR 條件如下：95 ℃ 1 min，94 ℃ 25 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，40 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 3 min。擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物以熒光染料SYBR Green I 標(biāo)記，在每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)測(cè)定每孔SYBR GreenⅠ吸光度值。反應(yīng)結(jié)束后對(duì)PCR 產(chǎn)物做55 ℃ 到95 ℃的融解曲線(xiàn)分析，12 ℃終止反應(yīng)。以人GAPDH為內(nèi)參照，引物序列如表1所示。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平用2-ΔΔCt方法[16]計(jì)算。

表1 實(shí)時(shí)定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)所用的引物

3.7Western blotting檢測(cè)caspase-8表達(dá) 用細(xì)胞蛋白裂解液處理hMSCs，收集細(xì)胞上清，行12% SDS-PAGE電泳。將細(xì)胞蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，封閉電轉(zhuǎn)膜，再分別以兔抗caspase-8單抗為Ⅰ抗，羊抗兔IgG-HRP為Ⅱ抗孵育電轉(zhuǎn)膜。內(nèi)參照蛋白選用GAPDH。用ECL+Plus試劑為底物，曝光X光片，顯色、定影。根據(jù)檢測(cè)caspase-8蛋白條帶和GAPDH蛋白條帶的灰度比值，進(jìn)行細(xì)胞樣品中caspase-8蛋白表達(dá)的半定量分析。

3.8Annexin V/PI染色分析 用冰冷的PBS清洗hMSCs，離心，棄上清用annexin結(jié)合液重懸。調(diào)整細(xì)胞密度1×109cells/L，加5 μL Alexa Fluor 488 annexin V和1 μL PI工作液(100 mg/L)到每100 μL的細(xì)胞懸液中。室溫避光孵育15 min。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，發(fā)射波長(zhǎng)為488 nm，F(xiàn)ITC-annexin V熒光檢測(cè)波長(zhǎng)為(530±15) nm, PI熒光檢測(cè)波長(zhǎng)為600 nm。

3.9caspase-8活性檢測(cè) 參照caspase-8活性檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明，制備hMSCs細(xì)胞裂解液，利用Glomax2020發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)hMSCs細(xì)胞的caspase-8活性。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0軟件分析，滿(mǎn)足方差齊性時(shí)，組間比較用單因素方差分析；不滿(mǎn)足方差齊性時(shí)，組間比較用秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 重組caspase-8 shRNA腺病毒的制備

經(jīng)KpnI+HindIII酶切和DNA測(cè)序鑒定表明，分別針對(duì)人caspase-8基因靶序列aagggtcatgctctatcagat和cagtgccagacacagtctgta的caspase-8 shRNA腺病毒穿梭質(zhì)粒pAd-Cap8 shRNA1和pAd-Cap8 shRNA2構(gòu)建成功(本文未顯示)。熒光定量PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pAd-Cap8 shRNA1介導(dǎo)表達(dá)的Cap8 shRNA能有效抑制HEK293細(xì)胞中caspase-8 的mRNA表達(dá)，見(jiàn)圖1A。利用pAd-Cap8 shRNA1質(zhì)粒和腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-I繼續(xù)構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒rAdTrack-Cap8 shRNA1。PacI酶切鑒定顯示，pAdTrack-CMV被切成6.0 kb和3.0 kb的片段，pAdEasy-I被切成33 kb的片段，而通過(guò)BJ5183菌重組的腺病毒質(zhì)粒rAdTrack- Cap8 shRNA1被切成21.5 kb和4.5 kb的片段，說(shuō)明pAd-Cap8 shRNA1和腺病毒骨架質(zhì)粒發(fā)生了重組，見(jiàn)圖1B。重組Cap8 shRNA腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK239細(xì)胞48 h后，有少量細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白，7～10 d后，全部HEK293細(xì)胞中表達(dá)GFP，細(xì)胞形成大量病毒斑、細(xì)胞發(fā)生融合及部分細(xì)胞漂浮，見(jiàn)圖1C，表明重組Cap8 shRNA腺病毒在HEK293細(xì)胞中成功包裝合成。經(jīng)過(guò)2次擴(kuò)增后，用反復(fù)凍融法收集包裝好的病毒上清。

Figure 1. Preparation of recombinant adenovirus carrying caspase-8 shRNA.A: the mRNA expression of caspase-8 in caspase-8 (Cap8) shRNA-modified HEK293 cells detected by real-time PCR.Mean±SD.n=3. ##P<0.01 vs Vector. B: restriction endonuclease digestion of rAdTrack-Cap8 shRNA1 detected by electrophoresis through an 8 g/L agarose gel and ethidium bromide staining. M: DL15000 DNA ladder marker; 1: pAdEasy-I digested by Pac I; 2: rAdTrack-Cap8 shRNA1 digested by PacⅠ; 3: pAdTrack-CMV digested by PacⅠ. C: packaging of rAd-Cap8 shRNA in HEK293 cells.

2 腺病毒介導(dǎo)caspase-8 shRNA調(diào)控hMSCs中caspase-8的表達(dá)

當(dāng)MOI為5時(shí)，重組caspase-8 shRNA腺病毒可有效感染hMSCs，hMSCs中有大量的GFP表達(dá)，見(jiàn)圖2A。Real-time PCR結(jié)果顯示，與hMSCs和陰性對(duì)照腺病毒感染的hMSCs相比，caspase-8 shRNA腺病毒感染的hMSCs中caspase-8 mRNA顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)圖2B；Western blotting結(jié)果顯示，caspase-8 shRNA腺病毒感染的hMSCs中，caspase-8蛋白水平顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)圖2C。

3 Caspase-8 shRNA抑制去血清/缺氧誘導(dǎo)的hMSCs凋亡

流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，去血清和缺氧培養(yǎng)可顯著提高h(yuǎn)MSCs凋亡率，而腺病毒介導(dǎo)的過(guò)表達(dá)caspase-8 shRNA可有效降低hMSCs的凋亡率(P<0.01)，見(jiàn)圖3A。Caspase-8活性分析結(jié)果顯示，去血清和缺氧培養(yǎng)的hMSCs中caspase-8活性顯著升高，而caspase-8 shRNA可顯著降低hMSCs中caspase-8活性(P<0.01)，見(jiàn)圖3B。

4 Caspase-8 shRNA增強(qiáng)hMSCs中HGF、IGF-1和Bcl-2的表達(dá)

利用real-time PCR檢測(cè)了hMSCs中與增殖、凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)caspase-8 shRNA的hMSCs中，HGF、IGF-1和Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.05，P<0.01)，而VEGF和Bcl-xL的表達(dá)變化不明顯，見(jiàn)圖4。

Figure 2. Adenovirus-mediated caspase-8 shRNA inhibited caspase-8 expression in hMSCs. A: green fluorescent protein expression in MSCs infected with rAd-GFP or rAd-Cap8 shRNA, respectively; B: caspase-8 mRNA expression in caspase-8 shRNA-overexpressing MSCs detected by real-time PCR assay; C: caspase-8 protein expression in caspase-8 shRNA-overexpressing MSCs detected by Western blotting.Mean±SD.n=3～5.##P<0.01 vs MSC; **P<0.01 vs MSC-vector.

Figure 3. Adenovirus-mediated caspase-8 shRNA inhibited apoptosis of MSCs under the condition of serum deprivation (SD) and hypoxia. A: Annexin V/PI staining; B: quantification of apoptotic cells; C: changes of caspase-8 activity. Mean±SD.n=3～5. **P<0.01 vs MSC; ##P<0.01 vs MSC-vector.

Figure 4. Adenovirus-mediated caspase-8 shRNA enhanced HGF, IGF-1 and Bcl-2 expression in hMSCs. Mean±SD.n=3～5.*P<0.05, **P<0.01 vs MSC; #P<0.05, ##P<0.01 vs MSC-vector.

討 論

MSCs能夠自我更新并可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、骨骼肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞等[5]。由于MSCs便于分離和體外擴(kuò)增培養(yǎng)，并具有多分化潛能，使得MSCs成為用于心臟再生的一種有希望的干細(xì)胞來(lái)源。然而移植到損傷心肌內(nèi)MSCs不能有效存活的情況極大地限制了MSCs的臨床應(yīng)用。研究顯示[17-18]，超過(guò)99%的MSCs在注入到CB17 SCID成年小鼠左心室肌的4 d內(nèi)死亡。鑒于心肌梗死區(qū)內(nèi)的缺血微環(huán)境可能不利于MSCs存活和抵抗凋亡，如何提高M(jìn)SCs在缺血條件下的生存能力對(duì)于MSCs成功應(yīng)用于細(xì)胞治療將是至關(guān)重要的。

近年來(lái)，人們研究通過(guò)對(duì)MSCs進(jìn)行預(yù)處理和基因修飾等不同的策略來(lái)提高M(jìn)SCs移植后的存活率和治療效果。目前，已有大量的研究表明通過(guò)基因修飾手段可以提高M(jìn)SCs移植后的存活率[10]。鑒于上述大多數(shù)措施增加MSCs生存能力是通過(guò)下調(diào)凋亡相關(guān)途徑實(shí)現(xiàn)的，因而，本文采取了直接抑制MSCs凋亡相關(guān)基因caspase-8表達(dá)的策略，研究過(guò)表達(dá)caspase-8 shRNA對(duì)MSCs抗凋亡的作用。研究發(fā)現(xiàn)，雖然低氧預(yù)適應(yīng)能增強(qiáng)MSCs的生存[19-21]，但MSCs在長(zhǎng)期的缺氧和缺乏營(yíng)養(yǎng)條件下將發(fā)生顯著凋亡[22]。以往的研究顯示，線(xiàn)粒體途徑介導(dǎo)了缺氧和去血清誘導(dǎo)的MSCs凋亡，盡管缺氧和去血清可誘導(dǎo)Fas和FasL表達(dá)，升高caspase-8活性，但用caspase-8抑制劑zIEDT-fmk 并不能降低caspase-3活性，抑制MSCs凋亡[23]。而本文研究顯示，缺氧和去血清處理MSCs 6 h，繼續(xù)常氧和完全培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h，可誘導(dǎo)明顯的MSCs凋亡，伴有caspase-8活性的顯著升高；腺病毒介導(dǎo)過(guò)表達(dá)caspase-8 shRNA可降低caspase-8表達(dá)，抑制caspase-8活性，并有效降低缺氧和去血清誘導(dǎo)的MSCs凋亡。因此，利用caspase-8 shRNA特異降低MSCs的caspase-8表達(dá)和活性，可有效抑制缺氧和去血清誘導(dǎo)的MSCs凋亡。既往研究顯示，沉默MSCs中caspase-3表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞凋亡[24]。鑒于caspase-3處于凋亡有序級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，結(jié)合本文研究結(jié)果，提示caspase-8活化參與的死亡受體凋亡途徑在缺氧和去血清處理MSCs凋亡中發(fā)揮重要作用。同時(shí)，本文定量PCR結(jié)果顯示，caspase-8 shRNA過(guò)表達(dá)的MSCs中抗凋亡相關(guān)HGF、IGF-1和Bcl-2表達(dá)顯著升高，提示上述基因表達(dá)增加也促進(jìn)了MSCs抗缺氧和去血清誘導(dǎo)的凋亡作用。但caspase-8 shRNA過(guò)表達(dá)的MSCs中HGF、IGF-1和Bcl-2表達(dá)升高的調(diào)控機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

本研究我們采用了基于miR-155前體骨架(stem-loop序列)的DNA模板表達(dá)caspase-8 shRNA，并獲得了有效的抑制MSCs中caspase-8表達(dá)的作用。既往的研究中，我們證實(shí)基于微小RNA骨架(如miR-30和miR-155)的DNA模板轉(zhuǎn)錄的目的基因shRNA比普通的發(fā)夾RNA能更有效抑制目的基因表達(dá)，而其中基于miR-155骨架DNA表達(dá)的目的基因shRNA的作用效能更好[15]。

因而，本文利用缺氧和去血清誘導(dǎo)的MSCs凋亡模型和腺病毒介導(dǎo)的基于miR-155前體骨架模板表達(dá)的caspase-8 shRNA，證實(shí)利用caspase-8 shRNA沉默MSCs中caspase-8表達(dá)可有效抑制MSCs凋亡。本文結(jié)果提示利用腺病毒介導(dǎo)caspase-8 shRNA修飾MSCs可能是一種提高M(jìn)SCs移植后成活率的有效方法。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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