劉艷娟， 周 斌， 蔣碧梅， 童中藝， 孫 麗， 李媛彬， 肖獻(xiàn)忠

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，湖南 長(zhǎng)沙 410078)

核仁素(nucleolin， Ncl)是目前發(fā)現(xiàn)的271種核仁蛋白質(zhì)中含量最多的一種,約占核仁蛋白質(zhì)總量的10%[1],是細(xì)胞內(nèi)一個(gè)非常重要的具有多功能的穿梭蛋白。研究表明,核仁素具有多種生物學(xué)功能,如調(diào)控核糖體的生物合成與成熟，調(diào)控細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、胚胎發(fā)生、胞質(zhì)分裂、染色質(zhì)復(fù)制與核仁的發(fā)生等過(guò)程[2-5]。本實(shí)驗(yàn)室前期工作中發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激導(dǎo)致的心肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)伴有核仁素的斷裂及表達(dá)下調(diào)[6-7]；核仁素過(guò)表達(dá)則可明顯增強(qiáng)心肌細(xì)胞的抗損傷能力[8]。目前已有研究使用轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行整體水平實(shí)驗(yàn)[9]，但現(xiàn)階段對(duì)核仁素的心肌保護(hù)作用及其機(jī)制的研究往往只局限于細(xì)胞水平，缺乏整體水平證據(jù)。本研究建立并鑒定了攜帶有外源核仁素基因的轉(zhuǎn)基因小鼠, 為從整體水平上研究核仁素對(duì)心肌功能的影響, 并為其發(fā)揮心肌保護(hù)作用的機(jī)制研究提供動(dòng)物模型。

材 料 和 方 法

1 材料

H9C2細(xì)胞(大鼠心肌細(xì)胞株)由本校細(xì)胞中心提供。pcDNA3.l質(zhì)粒為我科室保存,含α-肌球蛋白重鏈(α-myosin heavy chain, α-MyHC)啟動(dòng)子的質(zhì)粒Alpha-MyHC clone 26為南京大學(xué)模式動(dòng)物研究中心饋贈(zèng)。C57BL/6小鼠購(gòu)買(mǎi)于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究中心。GAPDH單克隆抗體購(gòu)于Cell Signaling。兔抗核仁素單克隆抗體購(gòu)于Sigma-Aldrich。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠、山羊抗兔均購(gòu)自Boster Biological Technology。

2 方法

2.1質(zhì)粒 Alpha-MyHC clone 26-Ncl的建立 提取小鼠心臟總RNA，用 RT-PCR 擴(kuò)增小鼠Ncl全長(zhǎng)cDNA，將擴(kuò)增片段插入 pcDNA3.1 載體，經(jīng)測(cè)序并比對(duì)正確無(wú)突變堿基后，以SalI內(nèi)切酶酶切，回收Ncl片段，并克隆入α-MyHC啟動(dòng)子下游構(gòu)建心臟特異性核仁素表達(dá)載體(Alpha-MyHC clone 26-Ncl)，挑取抗氨芐青霉素的陽(yáng)性克隆菌并擴(kuò)增后，用小量質(zhì)粒DNA提取試劑盒抽提質(zhì)粒。一部分采用SalI內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，一部分測(cè)序鑒定。

2.2心臟特異性高表達(dá)核仁素轉(zhuǎn)基因小鼠的建立 此工作委托南京大學(xué)模式動(dòng)物研究中心完成。將Alpha-MyHC clone 26-Ncl 質(zhì)粒采用顯微注射的方法注入小鼠受精卵雄性原核,將注射后的受精卵移植入假孕小鼠輸卵管內(nèi),獲得首建小鼠。

2.3轉(zhuǎn)基因小鼠基因型的鑒定 剪取5 mm小鼠尾巴，提取尾巴組織DNA，并委托上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)并合成核仁素PCR擴(kuò)增引物，上游引物5’-AGTGAGGAAGATGCCAAAGC-3’,下游引物5’-GAAGGACACCTAGTCAGACA-3’。再以提取的小鼠尾巴組織DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),溴化乙啶染色后于紫外透射儀攝像。

2.4Western blotting法檢測(cè)各組織中Ncl的表達(dá) 分別取轉(zhuǎn)基因小鼠的肝、腎、腦、心臟組織，提取各組織中的蛋白后用BCA法測(cè)蛋白濃度，取30 μg蛋白裂解液經(jīng)12% SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)移法將膠上蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用封閉緩沖液室溫下封閉4 h，然后加入兔Ncl單克隆抗體(1∶1 000稀釋)于搖床上,室溫下反應(yīng)2 h。用洗膜液洗去I抗后,加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗兔IgG II抗(1∶1 000稀釋)于搖床上,反應(yīng)1 h后,洗膜液洗去Ⅱ抗。用DAB顯色,進(jìn)行灰度掃描及定量分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 小鼠核仁素基因的心肌特異性表達(dá)質(zhì)粒Alpha-MyHC clone 26-Ncl的建立與鑒定

為了構(gòu)建心肌特異性高表達(dá)核仁素的轉(zhuǎn)基因小鼠,我們首先采用SalⅠ內(nèi)切酶分別酶切pcDNA3.1-Ncl和Alpha-MyHC clone 26質(zhì)粒，再采用基因重組的方法,將小鼠核仁素基因插入至心肌特異性表達(dá)載體Alpha-MyHC clone 26)中，構(gòu)建含小鼠核仁素基因的心肌特異性表達(dá)質(zhì)粒Alpha-MyHC clone 26-Ncl，分別采用NotI和SalI進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果顯示SalI酶切后產(chǎn)生了一條約2.1 kb大小的片段，而NotI酶切后出現(xiàn)一條約3 kb大小的片段，與預(yù)期結(jié)果相符 (圖1A)，進(jìn)一步測(cè)序鑒定其序列的正確性(圖1B)。上述結(jié)果提示含有小鼠核仁素基因的心肌特異性表達(dá)質(zhì)粒Alpha-MyHC clone 26-Ncl構(gòu)建成功。

2 心肌特異性高表達(dá)核仁素轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定

剪取少許小鼠尾巴提取組織DNA,采用PCR方法鑒定首建鼠(F0代)基因型,發(fā)現(xiàn)共有4只首建鼠為陽(yáng)性小鼠,分別為51號(hào)、52號(hào)、56號(hào)和86號(hào)。其中首建鼠52號(hào)和86號(hào)繁殖良好,并保留有核仁素高表達(dá)特性。目前為止共繁殖到F6代。圖2顯示部分首建鼠基因鑒定結(jié)果。

Figure 1. Identification of myocardium-specific nucleolin-expressing plasmid (Alpha-MyHC clone 26-Ncl) by restriction enzyme digestion (A) and sequencing (B). M: DNA marker; 1: without digestion; 2: digested by Not I; 3: digested by Sal I.

Figure 2. Identification of the founders by PCR.M: DNA mar-ker; P: positive control; B6: wild-type mice; N: negative control.

3 轉(zhuǎn)基因小鼠心肌中核仁素的表達(dá)情況

分別剪取轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠心肌、肝、肺、腎和腦組織,提取組織蛋白后,采用Western blotting檢測(cè)核仁素蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示,核仁素在轉(zhuǎn)基因小鼠心肌組織中特異性高表達(dá),轉(zhuǎn)基因小鼠心肌組織中核仁素蛋白水平明顯高于野生型小鼠(圖3),其中52系首建鼠子代心肌組織內(nèi)核仁素表達(dá)量約為野生型2.05倍,86系首建鼠子代心肌組織內(nèi)核仁素表達(dá)量約為野生型3.61倍。

4 心肌特異性高表達(dá)核仁素對(duì)小鼠心臟重量指數(shù)(heart weight index，HWI)、心功能及心肌形態(tài)學(xué)的影響

分別稱(chēng)取轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠的體重與心臟重量，計(jì)算HWI(心臟重量/體重)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)心臟體重指數(shù)未見(jiàn)明顯差別，見(jiàn)圖4A。采用PowerLab裝置檢測(cè)血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)兩者無(wú)明顯差別，見(jiàn)圖4B。收集各組的心肌組織,進(jìn)行石蠟包埋、切片、HE染色,于顯微鏡下觀(guān)察,發(fā)現(xiàn)兩者心肌組織形態(tài)無(wú)明顯差異,見(jiàn)圖4C。這些結(jié)果表明，與野生型小鼠相比，核仁素轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟大小、心臟功能和心肌細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化。

Figure 3. The expression of nucleolin (Ncl) protein in the myocardium and other tissues measured by Western blotting. A: expression of Ncl protein in cardiac tissues of transgenic (TG) and wild-type (WT) mice; B: expression of Ncl in myocardium and other tissues in transgenic mice (86 line). Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs WT; #P<0.05 vs liver, lung, kidney or brain.

Figure 4. The effects of nucleolin overexpression on heart weight index (HWI; A)， left ventricular pressure maximum rise rate (LV+dp/dtmax； B)and myocardial morphology (C; HE staining,×200) in transgenic mice.Mean±SD.n=6.

討 論

核仁素作為細(xì)胞核仁中含量最豐富的磷酸蛋白具有多種生物學(xué)功能。本實(shí)驗(yàn)室前期工作中發(fā)現(xiàn)核仁素表達(dá)下調(diào)能觸發(fā)心肌細(xì)胞凋亡，過(guò)表達(dá)則可明顯增強(qiáng)心肌細(xì)胞的抗損傷能力[8],核仁素還可通過(guò)與HSP70 mRNA的 3’UTR 相結(jié)合, 增強(qiáng) HSP70 mRNA 的穩(wěn)定性, 上調(diào)HSP70的表達(dá),進(jìn)而在心肌缺血預(yù)適應(yīng)中起作用[10]。整體動(dòng)物水平實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，核仁素能調(diào)控?zé)嵝菘说鞍?2的表達(dá)進(jìn)而在心肌缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌損傷中起保護(hù)作用[11]。但核仁素在整體動(dòng)物水平是否起保護(hù)作用，目前尚不十分清楚。為了解決此問(wèn)題，本研究構(gòu)建了具有表達(dá)核仁素能力的真核質(zhì)粒，然后用該序列構(gòu)建帶有心肌細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的心肌細(xì)胞核仁素表達(dá)質(zhì)粒，成功制備了轉(zhuǎn)基因小鼠。

本實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建利用原核顯微注射法，即將基因(真核表達(dá)質(zhì)粒)注射到受精卵的雄性原核。該表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建分兩步實(shí)現(xiàn)：首先，以pcDNA3.1質(zhì)粒為載體，插入小鼠核仁素表達(dá)序列，構(gòu)建成pcDNA3.1-Ncl；其次,將pcDNA3.1-Ncl中的核仁素序列插入到Alpha-MyHC clone 26質(zhì)粒中Alpha-MyHC啟動(dòng)子下游，構(gòu)成Alpha-MyHC clone 26-Ncl心肌細(xì)胞特異性表達(dá)核仁素質(zhì)粒。再利用其核仁素全長(zhǎng)cDNA基因構(gòu)建Alpha-MyHC clone 26-Ncl表達(dá)質(zhì)粒，并以此進(jìn)行顯微注射，從而制備了核仁素的轉(zhuǎn)基因小鼠。采用Western blotting方法觀(guān)察到轉(zhuǎn)基因小鼠心肌中核仁素表達(dá)量明顯高于野生鼠；與野生型小鼠相比較，心肌中核仁素過(guò)表達(dá)對(duì)小鼠的心臟、心肌形態(tài)學(xué)改變及心功能改變無(wú)明顯影響，提示心肌特異性高表達(dá)核仁素轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建成功。

本研究制備的心肌特異性表達(dá)核仁素的轉(zhuǎn)基因小鼠，可作為整體動(dòng)物模型用于核仁素蛋白的心肌保護(hù)作用及機(jī)制的研究，也可用于其它心血管疾病的研究。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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