王 輝， 陳 驍， 項夏霖， 彭 鑫， 王苑芳， 劉填桂， 黃樹林， 邵紅偉

(廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點實驗室， 廣東藥學院生命科學與生物制藥學院，生物制藥研究所， 廣東 廣州 510006)

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver di-sease, NAFLD)是一種排除過量飲酒和其它明確的肝損傷因素之外所致的類似酒精性脂肪性肝病理改變的綜合征，包括單純脂肪肝(steatosis)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纖維化及肝硬化[1]。隨著生活水平的提高，與膳食結(jié)構(gòu)、肥胖、代謝性疾病密切相關(guān)的NAFLD發(fā)病率逐漸增高并呈現(xiàn)全球化、低齡化趨勢。據(jù)報道，西方國家的成人NAFLD的發(fā)病率達20%～30%，其中NASH為2%～3%，約1/3 NASH病人并發(fā)進展性肝纖維化和肝硬化[2]。我國脂肪肝的發(fā)病率已占平均人口的10%，在肥胖、糖尿病高危人群中可高達50%～60%。國外大量臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)NAFLD已成為西方國家繼HBV和HCV后引起肝癌的第3個重要原因[3]。

游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)與脂肪肝發(fā)病密切相關(guān)。脂肪肝病人常表現(xiàn)為肝臟攝取和合成FFA增加，F(xiàn)FA在肝線粒體內(nèi)氧化和利用減少。FFA增加超過肝組織的氧化能力使FFA過度沉積造成脂毒性，表現(xiàn)為肝細胞脂肪變性和脂性凋亡[4]。本研究利用FFA混合物作用于人肝細胞L-02，觀察其對L-02細胞脂肪變性、細胞損傷及脂代謝相關(guān)基因表達的影響，從而為研究NAFLD的發(fā)病機理和發(fā)現(xiàn)有效的治療靶點奠定實驗基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 材料

油酸(oleic acid)、軟脂酸(palmitic acid)、牛血清白蛋白、尼羅紅(Nile red)、MTT和DMSO購自Sigma；人L-02細胞株購自中國科學院細胞庫；BCA法蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；甘油三酯(triglyceride，TG)酶法測定試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)測定試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司；DMEM培養(yǎng)基和Trizol試劑購自Invitrogen；胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司；Annexin V-PI凋亡檢測試劑盒購自BD；GoScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega；SYBR Fast MasterMix(2×)購自Roche。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng)及給藥 人肝細胞系L-02用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。每2～3 d傳代1次，所有實驗均采用處于2～5代對數(shù)生長期的細胞。 L-02細胞培養(yǎng)至生長密度達到80%以上，分別用正常培養(yǎng)基和0.5、1、2 mmol/L FFA混合物(油酸∶軟脂酸=2∶1)培養(yǎng)24 h后測定指標。

2.2激光共聚焦顯微鏡觀察細胞脂肪堆積 尼羅紅可對脂肪特異性染色。L-02細胞接種于放有蓋玻片的35 mm平板中爬片生長至密度80%以上，用不同濃度FFA混合物培養(yǎng)24 h后，細胞用1 μmol/L 尼羅紅染液1 mL室溫避光染色15 min，奧林巴斯激光共聚焦顯微鏡(488 nm excitation/543 nm emission)觀察細胞內(nèi)脂肪堆積情況。

2.3流式細胞術(shù)測定細胞脂肪堆積 不同濃度FFA混合物培養(yǎng)24 h的細胞經(jīng)胰酶消化后，1 000 r/min離心5 min，收集細胞后用冰PBS洗滌細胞2次。細胞重懸于1 μmol/L 尼羅紅染液1 mL，小心吹打混勻。室溫避光放置30 min染色，1 000 r/min離心5 min，冰PBS洗滌細胞2次，重懸于1 mL PBS，流式細胞儀(490 nm excitation/570 nm emission;Beckman Coulter)隨機計數(shù)10 000個細胞檢測其熒光強度。

2.4TG測定 收集FFA混合物處理后的細胞，TG含量用組織細胞酶法測定試劑盒進行測定，細胞蛋白濃度用BCA法蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒測定，實驗重復(fù)3次。

2.5細胞存活率檢測 采用MTT法檢測細胞存活率。不同濃度FFA混合物處理接種于96孔板的L-02細胞(細胞密度50%)24 h后，每孔加入10 μL MTT儲存液(5 g/L)。培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)基每孔加入DMSO 100 μL，室溫振蕩5 min后多功能酶標儀570 nm波長處測定各孔的吸光度(A)。每組設(shè)4個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次，細胞存活率計算：

2.6流式細胞術(shù)測定細胞凋亡 Annexin V-PI凋亡檢測試劑盒分析細胞的凋亡情況。用不同濃度FFA混合物培養(yǎng)24 h的細胞經(jīng)胰酶消化后，1 000 r/min離心5 min，收集細胞用冰PBS洗滌細胞2次，1 000 r/min離心5 min。細胞重懸于500 μL binding緩沖液 ，分別加入5 μL Annexin V和5 μL PI，小心吹打混勻。室溫避光放置15 min，流式細胞儀隨機計數(shù)10 000個細胞并計算凋亡細胞百分率，實驗重復(fù)3次。

2.7ALT和AST測定 FFA混合物處理L-02細胞24 h后，吸取培養(yǎng)上清用ALT和AST測定試劑盒340 nm波長處測定1 min和2 minA值，根據(jù)試劑盒說明書利用吸光度差值ΔA計算ALT和AST活性，實驗重復(fù)3次。

2.8實時熒光定量PCR檢測脂代謝相關(guān)基因表達 Trizol試劑提取各組細胞總RNA并取5 μg RNA用GoScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒分別逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。脂肪分化相關(guān)蛋白(adipose differentiation-related protein,ADR)上游引物5′-gggatccctgtctaccaagc-3′，下游引物5′-agatgtcgcctgccatcacc-3′。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(sterol regulatory element-binding protein 1,SREBP-1)上游引物5′-acggcagcccctgtaacgaccactgtga-3′，下游引物5′-tgccaagatggttccgccactcaccagg-3′。β-actin上游引物5′-gactacctcatgaagatc-3′，下游引物 5′-gatccacatctgctggaa-3′。用Roche Light Cycler 480II實時定量PCR儀進行PCR擴增。反應(yīng)體系為：2× SYBR Fast Master Mix 10 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，無菌水補足體積至20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min， 1個循環(huán)；95 ℃ 10 s，62 ℃ 30 s，45個循環(huán)。檢測熒光信號并分析循環(huán)閾值(Ct)，ΔCt為目的基因與內(nèi)參照β-actin循環(huán)閾值的差值，ΔΔCt為對照組和實驗組ΔCt的差值，采用公式2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達量。每組設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，均數(shù)比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 FFA混合物誘導肝細胞L-02脂肪變性

如圖1所示，F(xiàn)FA混合物處理后，細胞內(nèi)脂滴成環(huán)狀位于細胞膜內(nèi)側(cè)，隨脂肪酸濃度增加L-02細胞內(nèi)紅色脂滴增大及數(shù)量增多。圖2顯示，各濃度FFA混合物可劑量依賴性增加肝細胞脂肪堆積。如圖3所示，各濃度FFA混合物可劑量依賴性增加肝細胞甘油三酯含量。與對照組相比，1 mmol/L FFA混合物處理的肝細胞甘油三酯含量增高2.6倍，與文獻報道[5]的NAFLD病人的情況(2.7倍)基本相同。

Figure 1. FFA mixture induced lipid accumulation in L-02 cells after Nile red staining by confocal laser scanning microscopy (×400).

Figure 2. Flow cytometric analysis of L-02 cell lipid content after FFA mixture treatment and Nile red staining. The flow cytometry diagram is a representative of three independent experiments.

Figure 3. Triglyceride(TG)content in L-02 cells treated with FFA mixture. Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control group.

2 FFA混合物對肝細胞L-02損傷的影響

如圖4所示，0.5 mmol/L和1 mmol/L脂肪酸混合物對細胞生長無明顯抑制作用，而2 mmol/L脂肪酸混合物可降低L-02細胞存活率(P<0.05)。如圖5所示，與對照組早期凋亡率(3.400±0.414)%和晚期凋亡率(2.600±0.402)%相比，2 mmol/L FFA混合物處理的L-02細胞早期凋亡率(6.275±1.368)%和晚期凋亡率(7.625±1.810)%增加(P<0.05)，而0.5 mmol/L和1 mmol/L FFA混合物對細胞凋亡無明顯影響。與對照組相比，各濃度FFA混合物培養(yǎng)上清中ALT和AST水平無顯著上升，見表1，說明FFA混合物處理未造成L-02細胞轉(zhuǎn)氨酶泄漏。1 mmol/L FFA混合物可誘導肝細胞脂肪變性但又不造成肝細胞損傷。

Figure 4. Effects of FFA mixture on L-02 cell viability.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control group.

Figure 5. Apoptosis-inducing effects of FFA mixture treatment on L-02 detected by flow cytometry.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control group.

3 FFA混合物上調(diào)L-02細胞ADRP和SREBP-1 mRNA的表達

與對照組相比，1 mmol/L FFA混合物作用后，L-02細胞的ADRP和SREBP-1 mRNA的表達分別上調(diào)2.660和2.758倍，見圖6。

表1 不同濃度FFA混合物對L-02細胞培養(yǎng)上清中ALT和AST活性的影響

討 論

油酸和軟脂酸是正常人和NAFLD病人肝臟中含量最豐富的脂肪酸[5]，添加油酸和軟脂酸也是脂肪肝細胞模型研究中最常見的方法。研究發(fā)現(xiàn)過多脂肪酸沉積在肝臟可引起一系列代謝改變并最終導致對肝細胞的脂毒性[4]。不同脂肪酸的作用差異較大，飽和脂肪酸軟脂酸可誘導肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并導致肝細胞凋亡，而不飽和脂肪酸油酸可減少和抑制軟脂酸對肝細胞的毒性[6]。Gómez-Lechón等[5]用不同比例的飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸來培養(yǎng)HepG2細胞和人原代肝細胞，發(fā)現(xiàn)軟脂酸的比例越高，對肝細胞的脂毒性越大。脂肪酸血清濃度為0.2～2 mmol/L，因此我們選用0.5、1和2 mmol/L這3個濃度的FFA混合物，參照人體油酸和軟脂酸的比例，以2∶1 比例聯(lián)合作用于肝細胞，觀察肝細胞的脂毒性。

Figure 6. The mRNA expression levels of two lipid metabolism-related molecules in FFA mixture-treated L-02 cells.ADRP: adipose differentiation-related protein; SREBP-1: sterol regulatory element-binding protein 1. Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control group.

在用于脂肪肝研究的細胞中，人原代肝細胞特性最接近人肝臟，但細胞來源缺乏。另一常用于脂肪肝研究的細胞是人肝細胞癌細胞系HepG2，但腫瘤細胞內(nèi)通常存在能量代謝過程的改變，如脂肪酸合成增加[7-8]和涉及脂質(zhì)代謝過程的甲胎蛋白高表達[9]。L-02細胞是永生化正常人肝細胞系，已被研究者廣泛應(yīng)用于脂肪肝的機理和藥物篩選研究[10-11]，因此我們在本研究中采用了L-02細胞作為受試對象。細胞形態(tài)學觀察、酶法檢測細胞內(nèi)甘油三酯含量和流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)脂質(zhì)堆積均證實1和2 mmol/L FFA混合物可明顯誘導肝細胞L-02脂肪變性。對細胞存活率、凋亡和培養(yǎng)上清中轉(zhuǎn)氨酶的檢測進一步確定了1 mmol/L FFA混合物未造成L-02細胞明顯損傷，而2 mmol/L FFA混合物對L-02具有毒性，這也與文獻報道一致[12-13]。

脂代謝相關(guān)基因與肝臟脂肪酸合成和積聚密切相關(guān)。ADRP是形成細胞內(nèi)脂滴的主要成分，在激活和貯存脂滴過程中發(fā)揮重要作用，可作為鑒定脂肪肝疾病的標志蛋白[14]。通過基因敲除和反義核苷酸可使ADRP含量降低，從而逆轉(zhuǎn)脂肪肝，改變脂類代謝[15]。SREBP-1是甘油三酯代謝中的重要轉(zhuǎn)錄因子, 可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控多個脂質(zhì)代謝中的關(guān)鍵酶[16-17]，其在肝臟過表達導致肝細胞脂變[18]。為進一步明確1 mmol/L FFA混合物誘導肝脂肪變性的機制，我們通過實時定量PCR技術(shù)證實1 mmol/L FFA混合物可上調(diào)肝細胞脂代謝相關(guān)基因ADRP和SREBP-1的表達。

[參 考 文 獻]

[1] 周 鑫, 韓德五, 李素紅,等.非酒精性脂肪性肝病在代謝綜合征相關(guān)的2型糖尿病發(fā)病中的作用[J].中國病理生理雜志, 2011, 27(7): 1352-1359.

[2] Gentile CL, Pagliassotti MJ. The role of fatty acids in the development and progression of nonalcoholic fatty liver disease [J]. J Nutr Biochem, 2008, 19(9): 567-576.

[3] 鄭 剛.非酒精性脂肪性肝病與肝癌關(guān)系研究進展[J]. 胃腸病學和肝病學雜志, 2012, 21(3): 216-220.

[4] 程 媛,尚 靖,張陸勇.脂毒性與非酒精性脂肪肝的研究進展[J].華西醫(yī)學, 2008,23(6)：1482-1484.

[5] Gómez-Lechón MJ, Donato MT, Martínez-Romero A, et al. A human hepatocellularinvitromodel to investigate steatosis [J]. Chem Biol Interact, 2007, 165(2):106-116.

[6] Malhi H, Gores GJ. Molecular mechanisms of lipotoxicity in nonalcoholic fatty liver disease [J]. Semin Liver Dis, 2008, 28(4):360-369.

[7] 鄭 杰. 腫瘤生物合成的異常及其臨床應(yīng)用[J]. 腫瘤, 2012, 32(1):74-78.

[8] Menendez JA, Lupu R. Fatty acid synthase and the lipogenic phenotype in cancer pathogenesis [J]. Nat Rev Cancer, 2007, 7(10):763-777.

[9] 李朝英, 李 剛. 甲胎蛋白的生物學功能 [J]. 世界華人消化雜志, 2011, 19(14):1436-1440.

[10] 王 川，亢渝俊，姜 政，等.水甘油通道蛋白9短發(fā)夾RNA的構(gòu)建與篩選及其對非酒精性脂肪性肝病細胞模型的作用[J].中華肝臟病雜志, 2013, 21(3):222-227.

[11] Cao J, Feng XX, Yao L ,et al. Saturated free fatty acid sodium palmitate-induced lipoapoptosis by targeting glycogen synthase kinase-3β activation in human liver cells[J]. Dig Dis Sci, 2014, 59(2):346-357.

[12] Feldstein AE, Werneburg NW, Canbay A, et al. Free fatty acids promote hepatic lipotoxicity by stimulating TNF-alpha expression via a lysosomal pathway [J]. Hepatology, 2004,40(1):185-194.

[13] Wu X, Zhang L, Gurley E, et al. Prevention of free fatty acid-induced hepatic lipotoxicity by 18beta-glycyrrhetinic acid through lysosomal and mitochondrial pathways [J]. Hepatology, 2008, 47(6):1905-1915.

[14] 劉 陽, 高士爭, 趙素梅. ADRP在脂滴形成中的作用 [J]. 中國醫(yī)藥科學, 2013, 3(8):44-46.

[15] 胡成穆,曹 琦, 李 俊. 酒精性脂肪肝脂質(zhì)代謝研究進展 [J]. 安徽醫(yī)藥, 2012, 16 (8):1045-1047.

[16] 蔣 越, 高運臻,潘玉春,等.固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白及其靶基因在脂肪代謝中的研究進展 [J]. 豬業(yè)科學,2009,(11):94-98.

[17] 湯曉麗, 鄧立彬,林加日,等. 固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1及其靶基因網(wǎng)絡(luò) [J]. 遺傳, 2013, 35(5):607-615.

[18] Higuchi N, Kato M, Shundo Y, et al. Liver X receptor in cooperation with SREBP-1c is a major lipid synthesis regulator in nonalcoholic fatty liver disease [J]. Hepatol Res, 2008, 38(11): 1122-1129.