全文淑， 金英順， 金吉哲， 樸尚國， 崔鎮(zhèn)花， 金海峰， 鄭海蘭， 李錦姬， 姜玉姬， 金 華， 李 燦

(延邊大學附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科，吉林 延吉 133000)

長期服用免疫抑制劑環(huán)孢素A(cyclosporine A, CsA)可導致慢性CsA腎毒性, 其病理特點為腎小管間質(zhì)炎癥和纖維化。慢性CsA腎毒性的發(fā)病機制還不十分清楚，但與炎性趨化因子[1]、轉(zhuǎn)化生長因子β1[2]、腎素-血管緊張素系統(tǒng) (renin-angiotensin system, RAS)[3]、細胞凋亡[4]等有關。其中，細胞凋亡扮演著重要的角色，因為腎小管上皮細胞凋亡使腎實質(zhì)細胞大量缺失，是纖維化形成的根本所在。臨床和動物實驗證實，CsA可激活凋亡前基因引起腎實質(zhì)細胞凋亡，利用TUNEL技術可以觀察到凋亡的細胞小體。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)是真核細胞的一種保護性應激反應，通過ERS細胞降低胞內(nèi)未折疊蛋白的濃度，阻礙未折疊蛋白發(fā)生凝集。然而過度的ERS可啟動細胞凋亡，是一條新的不同于經(jīng)典細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導通路，這一信號轉(zhuǎn)導通路包括非折疊蛋白反應和鈣離子起始信號等機制。ERS介導的細胞凋亡與定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 12 (caspase-12)、ERS標志分子免疫球蛋白結合蛋白(immunoglobulin-binding protein,BiP)和ERS相關促凋亡分子生長阻滯及DNA損傷誘導蛋白153(growth arrest and DNA damage-inducible protein 153, GADD153)的激活有關[5]。大量研究表明，過度ERS誘導的細胞凋亡參與了很多腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展。本研究以慢性CsA腎毒性大鼠為模型, 觀察過度ERS在慢性CsA腎毒性細胞凋亡中的作用機制。

材 料 和 方 法

1 材料

雄性Sprague-Dawley 大鼠(Charles River Technology)32只, 體重200～220 g,喂飼低鹽飼料(0.05% 鈉鹽，Teklad Premier), 隨機分為2組：對照組 (vehicle,VH;n=16)：皮下注射橄欖油 (1 mL·kg-1·d-1, Sigma)；毒性組 (CsA,n=16): 皮下注射 CsA (15 mg·kg-1·d-1, Novartis Pharma)。2組大鼠注射1周或4周后分別處死, 留取腎組織標本。

2 腎臟病理

腎臟病理及其損傷程度判定：腎組織由過碘酸-賴氨酸-多聚甲醛液固定, 石蠟包埋后切片(厚4 μm)。脫蠟后行三色(Masson trichrome) 染色，觀察腎小管間質(zhì)纖維化。腎小管間質(zhì)纖維化程度利用數(shù)字化顯微鏡分析儀(TDI Scope EyeTMVersion 3.0 for Windows,Olympus)，在100倍顯微鏡下，每張切片上至少觀察非重疊20個不同區(qū)域，獲取圖像，利用 Polygon Program定量計算腎皮質(zhì)受損部位的百分比(%/0.5 mm2)。由2個觀察者對每個樣本隨機進行盲法評分，取平均值。

3 免疫組織化學染色

石蠟包埋切片置二甲苯脫蠟和梯度乙醇中脫水, 室溫下(37 ℃) 0.3%過氧化氫/甲醛30 min處理后, PBS液洗3次。置微波爐中加熱行波爐抗原修復(98 ℃ 5 min)，PBS液洗3次。滴加非免疫性血清封閉液, 室溫下進行20 min。PBS液洗3次，在4 ℃下滴加BipⅠ抗 (Santa Cruz Biotechnology Inc.)孵育12～16 h。PBS液洗3次后滴加Ⅱ抗, 室溫孵育2 h。以DAB為底物顯色, 呈棕黃色為止(視具體情況調(diào)節(jié)時間)。自來水流水洗滌,復染蘇木素，常規(guī)樹脂封片。

4 免疫印跡法

提取的腎組織用蛋白質(zhì)溶解緩沖液[10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.6)、150 mmol/L NaCl、1%脫氧膽酸鈉、1% Triton X-100、0.1% 十二烷基硫酸鈉、1% 抑肽酶、2 mmol/L Na3VO4、1 mg/L leupeptin和1 mmol/L 苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)]制成勻漿,4 ℃下離心(1 500 r/min) 后, 取上清液測定蛋白濃度 (Bio-Rad); 20 μg 標本在十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳; 電轉(zhuǎn)膜 (90 V) 2 h后, 4 ℃下 置BiP抗體于非脂牛乳中以1∶1 000 濃度孵育12～16 h; 室溫下緩沖液液洗3次,加辣根過氧化物酶標記的驢抗兔IgG (Amersham) 1 h; 室溫下緩沖液液洗3次,增強發(fā)光 (ECLTM, Amersham) 和曝光。磷酸化的真核細胞翻譯起始因子2α(euka-ryotic initiation factor 2α,eIF2α)、GADD153、caspase-12和caspase-3的免疫印跡步驟與BiP類似。以β-actin為內(nèi)參照進行條帶分析。

5 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用SPSS 12.0 軟件進行單因素方差分析 (One-way ANOVA)，Bonferroni進行校正。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 慢性CsA腎毒性腎臟病理變化

CsA注射1周觀察不到明顯的腎臟病理改變，而CsA注射4周觀察到腎小管間質(zhì)帶狀纖維化和大量TUNEL陽性細胞，見圖1。

Figure 1. Trichrome staining (A) and TUNEL assay (B) of the renal tissues (×100). VH: vehicle group; CsA1: CsA treatment for 1 week; CsA4: CsA treatment for 4 weeks. Mean±SD. n=8.##P<0.01 vs VH.

2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激分子伴侶BiP蛋白的表達

結果顯示，對照組觀察到BiP蛋白在腎小管上皮細胞的表達;CsA 注射1周后其表達顯著增加，尤其是在腎小管間質(zhì)纖維化區(qū)域；CsA 注射4周后其表達下降，見圖2A。免疫印跡進一步證實BiP蛋白表達與免疫組化一致的趨勢，見圖2B。

3 eIF2α蛋白的表達

結果顯示，與對照組相比，CsA組eIF2α蛋白的表達明顯增加，呈時間依賴性 [1周: (135±18)%vs(105±8)%; 4周: (445±35)%vs(135±18)%,P<0.01],見圖3。

Figure 2. BiP expression detected by immunohistochemistry (A) and Western blotting (B). VH: vehicle group; CsA1: CsA treatment for 1 week; CsA4: CsA treatment for 4 weeks. Mean±SD. n=8. **P<0.01 vs VH; ##P<0.01 vs CsA1.

Figure 3. eIF2α expression detected by Western blotting. VH: vehicle group; CsA1: CsA treatment for 1 week; CsA4: CsA treatment for 4 weeks. Mean±SD. n=8. **P<0.01 vs VH; ##P<0.01 vs CsA1.

4 細胞凋亡相關基因的表達

結果表明，CsA 組caspase-12蛋白的表達1周達到高峰，4周降至正常水平，見圖4。與之相反，GADD153和caspase-3蛋白的表達隨CsA給藥時間逐漸遞增，見圖5、6。

Figure 4. Caspase-12 expression tested by Western blotting. VH: vehicle group; CsA1: CsA treatment for 1 week; CsA4: CsA treatment for 4 week. Mean±SD. n=8. **P<0.01 vs VH; ##P<0.01 vs CsA1.

Figure 5. GADD153 expression measured by Western blotting. VH: vehicle group; CsA1: CsA treatment for 1 week; CsA4: CsA treatment for 4 weeks. Mean±SD. n= 8. **P<0.01 vs VH; ##P<0.01 vs CsA1.

Figure 6. Caspase-3 expression determined by Western blotting. VH: vehicle group; CsA1: CsA treatment for 1 week; CsA4: CsA treatment for 4 weeks. Mean±SD. n= 8. **P<0.01 vs VH; ##P<0.01 vs CsA1.

討 論

因細胞凋亡而大量缺失腎實質(zhì)細胞最終形成腎臟纖維化或硬化是諸多腎臟疾病的發(fā)病機制之一。本研究利用慢性CsA腎毒性大鼠模型，觀察ERS與細胞凋亡在腎小管間質(zhì)纖維化中的作用。結果表明，ERS啟動了caspase-12依賴的細胞凋亡程序，通過eIF2α磷酸化以及細胞凋亡蛋白GADD153和caspase-3的激活，導致腎小管上皮細胞凋亡和纖維化形成，提示CsA所致的ERS反應和凋亡反應失衡有助于腎實質(zhì)細胞凋亡，從而參與慢性CsA腎毒性的發(fā)病。

機體內(nèi)環(huán)境需要動態(tài)平衡，一旦失去平衡即造成疾病的發(fā)生。物理、化學、遺傳、病理等因素導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境失衡, 形成ERS。ERS時其分子伴侶BiP分離而激活，此時已活化的蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)特異性地磷酸化eIF2α第51位絲氨酸，eIF2α磷酸化則失去起始蛋白質(zhì)翻譯的活性，進而蛋白質(zhì)合成受到抑制。eIF2α是一種參與真核翻譯起始的重要蛋白質(zhì)，是與細胞生存緊密相關的真核起始因子[6-7]。 在單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化模型或高糖誘導的人類近端腎小管上皮細胞培養(yǎng)實驗中，Chiang 等[8]和Lim等[9]分別報道，ERS分子伴侶BiP與激活的eIF2α在過度的ERS所誘導的腎小管細胞凋亡中扮演重要角色。在本實驗中，CsA誘導的ERS反應是雙向的，給大鼠CsA注射1周顯著上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白BiP蛋白的表達，而4周注射后其表達降至正常水平。免疫組化結果進一步證實BiP蛋白在腎小管上皮細胞中高表達，該區(qū)域正是CsA損傷的靶部位。反之，eIF2α蛋白的表達明顯增加，4周時達到高峰，呈時間依賴性。以上結果表明CsA所致的過度ERS持續(xù)激活eIF2α磷酸化，從而極度消耗了腎小管細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白BiP，最后導致慢性CsA腎毒性腎小管細胞內(nèi)環(huán)境受到損傷。

慢性CsA腎毒性以腎小管間質(zhì)帶狀纖維化為病理特征，腎實質(zhì)細胞凋亡是其分子發(fā)病機制之一。我們以往研究表明，CsA使腎入球動脈收縮導致缺血缺氧，從而激活腎內(nèi)腎素-血管緊張素系統(tǒng)、上調(diào)致纖因子轉(zhuǎn)化生長因子β1，以上因素均可調(diào)控促凋亡蛋白(Fas、Bax、caspase-3)和抗凋亡蛋白(Bcl-2、EGF)，有效控制腎實質(zhì)細胞凋亡。正常情況下，ERS反應可以成功地維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。但是，過度的、過長的ERS可激活caspase-12依賴的細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導途徑誘導細胞死亡。已知caspase-12屬于特異性的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)半胱氨酸蛋白酶，它是由ERS所激活繼而引起線粒體非依賴的caspase-3裂解。本實驗中，我們觀察到CsA 1周致caspase-12蛋白的高表達而后下降，而促凋亡蛋白GADD153和caspase-3的表達隨CsA給藥時間遞增，4周后達到頂峰。在腎臟病理組織中，CsA 1周觀察不到TUNEL陽性細胞，而4周后腎小管上皮細胞顯現(xiàn)出大量的TUNEL陽性細胞。這些結果提示凋亡前信號先于細胞凋亡，過度的ERS反應通過調(diào)控凋亡蛋白GADD153和caspase-3的表達導致細胞程序性死亡。

CsA誘導過度ERS和細胞凋亡的機制還不清楚，一種解釋是CsA發(fā)揮藥物毒性可直接引起ERS。有趣的是，Justo等[10]的體外實驗報道，CsA可誘導ERS相關性促凋亡分子CHOP,但不能激活ERS特異性的caspase-12凋亡經(jīng)典途徑。這些不同結果暗示CsA本身不足以引起細胞凋亡，尚需一些介質(zhì)協(xié)助完成凋亡程序，如活性氧自由基[11]、腎素血管緊張素系統(tǒng)[5]、 一氧化氮合酶[12]及天然免疫系統(tǒng)[13]等，因為這些都是ERS和細胞凋亡的誘發(fā)因素。基于以上理論，我們推測在慢性CsA腎毒性中，CsA本身協(xié)同其它介質(zhì)共同完成ERS相關的細胞凋亡。

在臨床實踐中，腎移植早期移植腎對CsA所致的ERS有較好的適應能力，因為體內(nèi)產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶。然而，由于對ERS反應的下降和細胞凋亡前途徑的激活，使得移植腎很難長期適應CsA的服用。因此，本實驗結果為臨床藥物減量或停用CsA以達到預防慢性CsA腎毒性之目的提供了分子理論基礎。

[參 考 文 獻]

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